体外诊断试剂主要原材料研究资料-人类 BCR/ABL融合基因P210 RNA扩增检测试剂盒（数字 PCR 法）

青草

人类 BCR/ABL融合基因P210 RNA扩增检测试剂盒（数字 PCR 法）主要原材料研究资料
主要原材料研究资料
提交申报产品主要原材料的研究资料，内容包括主要原材料的来源、选择、制备方法的研究资料及其质量标准的制订资料、评价结果和质量分析证书，并详细描述原材料的技术指标和验收标准。
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一、概述

白血病是我国十大高发恶性肿瘤之一，近年的临床研究表明，大部分白血病和淋巴瘤存在染色体畸变，如易位、缺失和突变等。染色体易位畸变大部分情况下会形成相关的融合基因，是白血病和淋巴瘤临床诊断的重要指标之一。
由t(9；22)(q34；q11)产生的费城染色体(Ph)在血液肿瘤中具有重要的诊断和预后意义，出现于90%以上的CML、30%成人ALL、2%~20%儿童ALL以及少数AML和MM患者。位于9q34的ABL基因与位于22q11的BCR基因相互易位产生的BCR-ABL融合基因会编码一种癌蛋白(p210BCR-ABL)，95%的CML患者表现为P210阳性，在ph阳性ALL中，P210约占1/3，因此融合基因BCR-ABL的亚型P210可作为白血病分型诊断、疗效评价以及治疗监测的可靠指标。
本报告主要是关于人类BCR/ABL融合基因P210RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法）主要原材料的研究，包括该试剂盒的相关信息以及主要原料的性状、性能等的研究。
二、人类 BCR/ABL融合基因P210 RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法）检测原理及相关信息

2.1检测原理

使用随机引物反转录结合液滴数字PCR（ddPCR）技术进行定量检测。e13a2（b2a2）和e14a2（b3a2）BCR-ABL易位同时扩增、检测和量化。样本为人类血液中提取的总RNA，对FAM通道中的两个BCR-ABL融合转录本e13a2（b2a2）和/或e14a2（b3a2）的副本进行定量检测，并以ABL转录本内源性对照进行定量。将BCR-ABL转录本的数量量化为BCR-ABL/ABL的比率，然后返回国际范围内的值。
2.2人类 BCR/ABL融合基因P210 RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法） 产品信息

包装规格：48人份/盒。
储存条件：-20℃条件下避光保存，有效期12个月。拆封后未使用完的试剂请立即-20℃条件下避光保存，并在8周内使用完且反复冻融次数不超过8次。
2.3人类 BCR/ABL融合基因P210 RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法） 组分



三、主要原料来源及制备方法

3.1 RNasin：将转染有包含RNasin表达基因的BL21(DE3)大肠杆菌于LB培养基中进行诱导表达；然后将大肠杆菌裂解产物用RNase A亲和层析进行纯化制得。
3.2逆转录酶（c-MMLV酶）：将逆转录酶基因插入至载体pET28a上，产生pET28a-MMLV RT质粒，具体合成序列包括3’端添加的纯化标签6×His序列和TAA终止密码子。将此质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行表达宿主构建，该质粒诱导表达后产生C端融合6×His纯化标签的MMLV逆转录酶。取发酵菌体以Ni亲和层析柱结合缓冲液重悬后，以细胞高压匀浆破碎仪破碎，低温高速离心收集破碎上清液，4℃环境下使用Ni亲和层析纯化柱进行纯化收集，得到MMLV逆转录酶突变体，配制于存储缓冲液中，低温保存。
3.3热启动TaqDNA聚合酶：
根据GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列D32013 .1，按照大肠杆菌偏好密码子，人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段；然后将优化的Taq DNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上，进行大肠杆菌转化和筛选，获得表达Taq DNA聚合酶的重组菌；然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析，完成Taq DNA聚合酶的浓缩和纯化；最后，将抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶进行特异性结合，完成Taq DNA聚合酶的配基修饰，即为热启动Taq DNA聚合酶。
3.4DNA引物和探针：使用****核酸分析软件分别对已知的融合基因BCR-ABL(P210）基因的核苷酸序列进行同源性比较，在找到同源区段的基础上，进一步使用****引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于BCR-ABL(P210）基因的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了融合基因BCR-ABL(P210）检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物和探针，用分子筛和快速蛋白质液相层析法（FPLC）纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团（报告基团）的6-FAM amidite，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的BHQ1。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶（20%）电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。
经检索，BCR/ABL mRNA (e13a2)序列如下：
gcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagt
BCR/ABL mRNA (e14a2)序列如下：gcgaacaagggcagcaaagctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcgcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccctaactacgacaagt
e13a2、e14a2引物和探针序列一致。
BCR-ABL正向引物序列：tccacagcattccgctgac
BCR-ABL反向引物序列位置：tttgagcctcagggtctgagtg
BCR-ABL探针序列：gcccttcagcggccagtagcatct
tgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaa为e14a2比e13a2多出部分。
内参基因ABL引物和探针的设计原则同上，5’端标记荧光发生基团（报告基团）为HEX。
经检索，ABL mRNA序列如下：
gcgaacaagggcagcaaggctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagt
BCR/ABL mRNA (e14a2)序列如下：gcgaacaagggcagcaaagctacggagaggctgaagaagaagctgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcgcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccctaactacgacaagt
e13a2、e14a2引物和探针序列一致。
BCR-ABL正向引物序列：tccacagcattccgctgac
BCR-ABL反向引物序列位置：tttgagcctcagggtctgagtg
BCR-ABL探针序列：gcccttcagcggccagtagcatct
tgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaa为e14a2比e13a2多出部分。
内参基因ABL引物和探针的设计原则同上，5’端标记荧光发生基团（报告基团）为HEX。
经检索，ABL mRNA序列如下：
gttaacaggcgcgtcccggccaggcggagacgcggccgcggccatgggcgggcgcgggcgcgcggggcggcggtgagggcggctggcggggccgggggcgccgggggggcgcgcgggccgagccgggcctgagccgggcccgcggaccgagctgggagaggggttccggcccccgacgtgctggcgcgggaaaatgttggagatctgcctgaagctggtgggctgcaaatccaagaaggggctgtcctcgtcctccagctgttatctggaagaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatgaagcacaagctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcgtgtggaagaaatacagcctgacggtggccgtgaagaccttgaaggaggacaccatggaggtggaagagttcttgaaagaagctgcagtcatgaaagagatcaaacaccctaacctggtgcagctccttggggtctgcacccgggagcccccgttctatatcatcactgagttcatgacctacgggaacctcctggactacctgagggagtgcaaccggcaggaggtgaacgccgtggtgctgctgtacatggccactcagatctcgtcagccatggagtacctggagaagaaaaacttcatccacagagatcttgctgcccgaaactgcctggtaggggagaaccacttggtgaaggtagctgattttggcctgagcaggttgatgacaggggacacctacacagcccatgctggagccaagttccccatcaaatggactgcacccgagagcctggcctacaacaagttctccatcaagtccgacgtctgggcatttggagtattgctttgggaaattgctacctatggcatgtccccttacccgggaattgacctgtcccaggtgtatgagctgctagagaaggactaccgcatggagcgcccagaaggctgcccagagaaggtctatgaactcatgcgagcatgttggcagtggaatccctctgaccggccctcctttgctgaaatccaccaagcctttgaaacaatgttccaggaatccagtatctcagacgaagtggaaaaggagctggggaaacaaggcgtccgtggggctgtgagtaccttgctgcaggccccagagctgcccaccaagacgaggacctccaggagagctgcagagcacagagacaccactgacgtgcctgagatgcctcactccaagggccagggagagagcgatcctctggaccatgagcctgccgtgtctccattgctccctcgaaaagagcgaggtcccccggagggcggcctgaatgaagatgagcgccttctccccaaagacaaaaagaccaacttgttcagcgccttgatcaagaagaagaagaagacagccccaacccctcccaaacgcagcagctccttccgggagatggacggccagccggagcgcagaggggccggcgaggaagagggccgagacatcagcaacggggcactggctttcacccccttggacacagctgacccagccaagtccccaaagcccagcaatggggctggggtccccaatggagccctccgggagtccgggggctcaggcttccggtctccccacctgtggaagaagtccagcacgctgaccagcagccgcctagccaccggcgaggaggagggcggtggcagctccagcaagcgcttcctgcgctcttgctccgcctcctgcgttccccatggggccaaggacacggagtggaggtcagtcacgctgcctcgggacttgcagtccacgggaagacagtttgactcgtccacatttggagggcacaaaagtgagaagccggctctgcctcggaagagggcaggggagaacaggtctgaccaggtgacccgaggcacagtaacgcctccccccaggctggtgaaaaagaatgaggaagctgctgatgaggtcttcaaagacatcatggagtccagcccgggctccagcccgcccaacctgactccaaaacccctccggcggcaggtcaccgtggcccctgcctcgggcctcccccacaaggaagaagctggaaagggcagtgccttagggacccctgctgcagctgagccagtgacccccaccagcaaagcaggctcaggtgcaccagggggcaccagcaagggccccgccgaggagtccagagtgaggaggcacaagcactcctctgagtcgccagggagggacaaggggaaattgtccaggctcaaacctgccccgccgcccccaccagcagcctctgcagggaaggctggaggaaagccctcgcagagcccgagccaggaggcggccggggaggcagtcctgggcgcaaagacaaaagccacgagtctggttgatgctgtgaacagtgacgctgccaagcccagccagccgggagagggcctcaaaaagcccgtgctcccggccactccaaagccacagtccgccaagccgtcggggacccccatcagcccagcccccgttccctccacgttgccatcagcatcctcggccctggcaggggaccagccgtcttccaccgccttcatccctctcatatcaacccgagtgtctcttcggaaaacccgccagcctccagagcggatcgccagcggcgccatcaccaagggcgtggtcctggacagcaccgaggcgctgtgcctcgccatctctaggaactccgagcagatggccagccacagcgcagtgctggaggccggcaaaaacctctacacgttctgcgtgagctatgtggattccatccagcaaatgaggaacaagtttgccttccgagaggccatcaacaaactggagaataatctccgggagcttcagatctgcccggcgacagcaggcagtggtccagcggccactcaggacttcagcaagctcctcagttcggtgaaggaaatcagtgacatagtgcagaggtagcagcagtcaggggtcaggtgtcaggcccgtcggagctgcctgcagcacatgcgggctcgcccatacccgtgacagtggctgacaagggactagtgagtcagcaccttggcccaggagctctgcgccaggcagagctgagggccctgtggagtccagctctactacctacgtttgcaccgcctgccctcccgcaccttcctcctccccgctccgtctctgtcctcgaattttatctgtggagttcctgctccgtggactgcagtcggcatgccaggacccgccagccccgctcccacctagtgccccagactgagctctccaggccaggtgggaacggctgatgtggactgtctttttcatttttttctctctggagcccctcctcccccggctgggcctccttcttccacttctccaagaatggaagcctgaactgaggccttgtgtgtcaggccctctgcctgcactccctggccttgcccgtcgtgtgctgaagacatgtttcaagaaccgcatttcgggaagggcatgcacgggcatgcacacggctggtcactctgccctctgctgctgcccggggtggggtgcactcgccatttcctcacgtgcaggacagctcttgatttgggtggaaaacagggtgctaaagccaaccagcctttgggtcctgggcaggtgggagctgaaaaggatcgaggcatggggcatgtcctttccatctgtccacatccccagagcccagctcttgctctcttgtgacgtgcactgtgaatcctggcaagaaagcttgagtctcaagggtggcaggtcactgtcactgccgacatccctcccccagcagaatggaggcaggggacaagggaggcagtggctagtggggtgaacagctggtgccaaatagccccagactgggcccaggcaggtctgcaagggcccagagtgaaccgtcctttcacacatctgggtgccctgaaagggcccttcccctcccccactcctctaagacaaagtagattcttacaaggccctttcctttggaacaagacagccttcacttttctgagttcttgaagcatttcaaagccctgcctctgtgtagccgccctgagagagaatagagctgccactgggcacctgcgcacaggtgggaggaaagggcctggccagtcctggtcctggctgcactcttgaactgggcgaatgtcttatttaattaccgtgagtgacatagcctcatgttctgtgggggtcatcagggagggttaggaaaaccacaaacggagcccctgaaagcctcacgtatttcacagagcacgcctgccatcttctccccgaggctgccccaggccggagcccagatacgggggctgtgactctgggcagggacccggggtctcctggaccttgacagagcagctaactccgagagcagtgggcaggtggccgcccctgaggcttcacgccgggagaagccaccttcccaccccttcataccgcctcgtgccagcagcctcgcacaggccctagctttacgctcatcacctaaacttgtactttatttttctgatagaaatggtttcctctggatcgttttatgcggttcttacagcacatcacctctttgcccccgacggctgtgacgcagccggagggaggcactagtcaccgacagcggccttgaagacagagcaaagcgcccacccaggtcccccgactgcctgtctccatgaggtactggtcccttccttttgttaacgtgatgtgccactatattttacacgtatctcttggtatgcatcttttatagacgctcttttctaagtggcgtgtgcatagcgtcctgccctgccccctcgggggcctgtggtggctccccctctgcttctcggggtccagtgcattttgtttctgtatatgattctctgtggttttttttgaatccaaatctgtcctctgtagtattttttaaataaatcagtgtttacattagaa
其中ABL正向引物：5’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’
ABL反向引物位置：5’-ttgacctgtcccaggtgtatga-3’
ABL探针：5’-atggcatgtccccttacccggga-3’
3.5去核酸酶水：用超纯的去离子水经DEPC处理后，再经过高压灭菌而来。经检测无核酸酶和蛋白酶活性，可用于cDNA合成、体外转录、RNA提取等对核酸酶敏感的分子生物学试验。
3.6 K562细胞系：K-562是由Lozzio从一位临终的53岁女性慢性骨髓性白血病患者的胸水中建立。K-562细胞被归入高度未分化的粒性白细胞类，Erson等对其表面膜性质的研究表明：K-562细胞是一株人类红白血病细胞。它能表达BCR-ABL1 e14a2（b3a2) ，是WHO第一代BCR-ABL1融合基因标准物质NIBSC code: 09/138所使用的细胞株。通过细胞传代培养获得。
3.7 HL60 细胞系：BCR-ABL1 阴性细胞系，该细胞由Collins SJ从一位患有急性早幼粒细胞性白血病的36岁白人女性的外周血中分离建立。是WHO第一代BCR-ABL1融合基因标准物质NIBSC code: 09/138所使用的细胞株（用做内参）。通过细胞传代培养获得。
三、主要原料选择及质量标准制定资料

4.1逆转录酶（c-MMLV酶的选择与质量标准的制定）

4.1.1制定逆转录酶活性的检测方法
4.1.1.1实验仪器：
荧光PCR仪。
4.1.1.2试剂
4.1.1.2.1 发夹型寡核苷酸序列（T2），序列为：
5'-tagcgaaggatgtgaacctaatcecTGCTCCCGCGGCCGatctgcCGGCCGCGGGAGCA-3'
4.1.1.2.2 dNTP。
注：dGTP：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸；dATP：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸；dTTP：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸；dCTP：三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸，dNTP；三磷酸碱基脱氧核苷酸，包括 dGTP、dATP、dTTP、dCTP。包括dCTP、dATP、dTTP、dGTP。
4.1.1.2.3 荧光核酸染料。
4.1.1.2.4 Lamda DNA标准品。
4.1.1.3溶液的配制
（1）1×TE溶液：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，pH 8.5（25 ℃）。
（2）PCR 缓冲液；500 mmol/LTris-HCl，750 mmol/L 氯化钾溶液，100 mmol/L DTT，pH 8.5 (25 ℃)。
（3）Lambda DNA预染液：以8.5 μL:1μL:0.5 μL的比例分别量取纯化水、10×PCR缓冲液和荧光核酸染料加入离心管，在漩涡混匀器上振荡混匀1 min 后在微型离心机上离心数秒，储存于2 ℃～8℃。
（4）氯化镁溶液：25 mmol/L。；
（5）酶稀释缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液，1 mmol/L DTT，50%（体积分数）甘油，pH8.0（25 ℃）。
（6） T2 溶液：将发夹型寡核苷酸序列（T2）干粉按照合成单上的说明稀释到 100 μmol/L，储存于-20 ℃。使用时从-20 ℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上混匀10 s，在微型离心机上离心数秒。
（7）dNTP混合液，将dNTP中的dCTP、dATP、dTTP、dGTP等体积进行温合，于漩涡混匀器上混匀10s，在微型离心机上离心数秒，配制成25 mmol/L的dNTP混合液。
（8）Lambda DNA标准品：使用1×TE溶液将Lambda DNA 标准品进行4倍连续梯度稀释，得到100μg/mL、25μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.125 μg/mL、1.5625μg/mL和0.78125μg/mL的8个浓度梯度溶液，以相同体积的1×TE溶液作为背景对照。各梯度溶液和背景对照分别加入等体积的预染液，于漩涡混匀器上混匀10 s，在微型离心机上离心数秒，以 20 μL/管分装于PCR八联管内，每个梯度3个重复，盖紧管盖，在微型离心机上离心数秒后备用。
（9）M-MLV反转录酶梯度释溶液，根据标定的酶比活力，使用酶稀释缓冲液对M-MLV反转录酶进行适当稀释（如标定浓度为200 U/μL，则可2倍稀释，得到2×、4×的梯度稀释液）。该步骤需在冰上进行。
4.1.1.4试验步骤
4.1.1.4.1 聚合反应液的配制与分装
4.1.1.4.1.1 在微量离心管中按照表 1的比例配制聚合反应液（冰上配制），聚合反应液配制完成后，在漩涡混匀器涡旋混匀10 s，微型离心机离心数秒。
配制总体积计算见下式：
V=[3×(n+1)+1]×V1
式中：
V—总体积，单位为微升（μL）；
3 —重复次数；
n—M-MLV反转录酶的稀释梯度数；
1—前一个1表示空白对照数；后一个1表示预留损失数量；
V—表示1个反应用量，见表1，单位为微升（μL）。
表1聚合反应液配比


4.1.1.4.1.2 将 4.1.5.1.1中的聚合反应液平均分装到 n 个（n为 M-MLV反转录酶的稀释梯度数）微量离心管中，分别加入1.2 μL 的各浓度梯度的 M-MLV反转录酶梯度稀释溶液和空白对照（酶稀释缓冲液），在漩涡混匀器涡旋混匀10 s，微型离心机离心数秒。各管混合液以 20 μL/管，分装于PCR八联管内，每管混合液3个重复，盖紧管盖，在微型离心机上离心数秒后备用。
4.1.1.4.2运行程序
在荧光 PCR仪上设置如下温度程序：
37℃ 16s
荧光采集通道：SYBR
120个循环
将装有Lambda DNA标准品和聚合反应液的 PCR八联管置干荧光 PCR.仪中.启动温康程序，开始聚合反应。
4.1.1.5数据分析
4.1.1.5.1 Lambda DNA标准曲线的制作
使用荧光 PCR仪的软件打开数据，导出文件，按以下步骤进行，按下式计算：
a）选取数据文件中 Lambda DNA 标准品和背景对照的第 25个循环的荧光值，并计算平均荧光值。
b） 将各梯度 Lambda DNA标准品的荧光值减掉背景对照的平均荧光值，得到净荧光值。
c） 计算各梯度净荧光值的平均值和标准偏差 SD。
d） 以Lambda DNA标准品 DNA量（ng）为 X 轴，以各梯度净荧光值的平均值为Y轴，标准偏差SD 为错误值进行多项式拟合分析，制作工作曲线，从中获得净荧光值与双链 DNA 浓度的关系曲线如下，R2≥0.98。
y=A+Bx
式中：
A —线性方程拟合曲线的截距；
B—线性方程拟合曲线的斜率；
C—y -荧光值；
x-—双链DNA的量，单位为纳克（ng）。
4.1.1.5.2 聚合反应新生成的双链 DNA量的计算
选取 Excel文件中待检 M-MLV反转录酶的第 70 个循环的荧光数据。首先计算空白对照3个重复的平均荧光值，将各梯度 M-MLV反转录酶的荧光值减掉空白对照的平均荧光值，得到净荧光值，计算各梯度净荧光值的平均值（y1）。将各净荧光值代人上式计算聚合反应新生成的双链 DNA量(x1)。
4.1.1.5.3 M-MLV反转录酶梯度条件下的 dNTP消耗量计算
M-MLV反转录酶梯度条件下的 dNTP消耗量以y2表示，单位为 nmol，按下式计算：
y2=x1/（2×324.5）
式中：
x1——新生成的双链DNA量，单位为纳克（ng）；
2——双链 DNA由2条单链 DNA组成；
324.5-—dNTP的相对平均分子质量。
4.1.1.5.4 M-MLV反转录酶活力计算
根据M-MLV反转录酶活性单位定义，M-MLV反转录酶酶活力以S表示，单位为U/μL。选择在0.014 nmol~0.196 nmol 范围内的 dNTP消耗量按照下式计算：
S=（y2+0.045）×D/0.0012
式中：
y2——dNTP消耗量，单位为纳摩尔（nmol）；
D——酶的稀释倍数。
4.1.2制定逆转录酶核酸外切酶活性的检测方法。
4.1.2.1 仪器和设备
4.1.2.1.1 恒温水浴槽。
4.1.2.1.2 台式离心机。
4.1.2.1.3 超净工作台。
4.1.2.1.4 恒温培养箱。
4.1.2.2 材料
4.1.2.2.1 高纯 CCC pUC19 DNA。
4.1.2.2.2 T4 DNA连接酶。
4.1.2.2.3 10× T4 DNA 连接酶缓冲液：500 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.8），100 mmol/L Mg2+，10 mmol/L ATP,100 mmol/L DTT。
4.1.2.2.4 LB培养液。
4.1.2.2.5 氯仿-异戊醇（24:1，体积比）。
4.1.2.2.6 大肠杆菌DH5a（感受态）。
4.1.2.2.7 LB平板【含β-半乳糖苷酶，异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），氨苄青霉素】。
4.1.2.3 实验步骤
4.1.2.3.1 长时程过量酶切
取10 μg 高纯 CCC pUC19 DNA 置于一只微量离心管中，加入 20 μL 10× BamHI缓冲液和150 μL水，充分混匀后平均分成A和B两管；A管加入5 μL BamHI（50 U～100 U）和5 μL水，达总体积100 μL；B管加人5μL BamHI（50 U～100 U）和5 μL M-MLV反转录酶（1 μg/μL）。混匀后置于37 ℃水浴槽，1 h后各取出 40 μL，其中 20 μL（标记 A1号和 B1号）待电泳检测，另 20 μL（标记A2号和 B2号）待连接及蓝白斑计数；所剩60 μL继续酶切达10 h 以上，又将它各均分为3管，分别标记A3、B3、A4、B4、A5、B5号。
4.1.2.3.2 电泳
4.1.2.3.2.1 取出 A1、B1、A3、B3号管，加入载样缓冲液，准备电泳检测。
4.1.2.3.2.2  1.5%琼脂糖，电泳电压5V/cm～10 V/cm，当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3 时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。
4.1.2.3.3 连接
4.1.2.3.3.1 回收 DNA
取出 A2、B2、A4、B4、A5、B5号管，各加入 20 μL氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白，再沉淀出DNA，并真空干燥样品。
4.1.2.3.3.2 连接反应
每管加入2 μL10× T4 DNA连接酶缓冲液，2U T4 DNA连接酶，加入水达总体积 20 μL，混匀后置于15℃水浴槽8 h。
4.1.2.3.3.3 转化与铺板
4.1.2.3.3.3.1 将感受态菌液加入含连接处理过的 DNA 微量离心管内，轻混，置于4 ℃冰浴槽0.5 h 以上。
4.1.2.3.3.3.2 将上述6只微量离心管移到 42 ℃水浴中热击2 min，迅即取出再置于4 ℃冰浴槽0.5 h 以上。
4.1.2.3.3.3.3 向上述6只微量离心管各加入1 mL LB培养液，轻混，置于37 ℃水浴槽1h。
4.1.2.3.3.3.4 将18块固态LB板，分别标上 A2、B2、A4、B4、A5、B5号，每号均有3块板；在超净工作台铺板，每板加入上述菌液 200 μL；待板上菌液不会流动时，翻转平板，置于37℃恒温培养箱8h 以上。
4.1.2.3.3.3.5 计算每块板蓝白斑数量，再算出每号管对应的每个处理的蓝白斑总数及百分比。
4.1.2.4 结果判定
在电泳板上，A1、B1、A3、B3号的谱带没有明显差异，说明长时程过量酶处理对 DNA 没有造成额外的切割。B2、B4、B5号和 A2、A4、A5号的白斑总数与其蓝斑总数相比，若比值小于1/9，则判定样品不含核酸外切酶；若比值大于或等于1/9，则判定样品含有核酸外切酶。
4.1.3制定逆转录酶核酸内切酶活性检测方法。
4.1.3.1 仪器
4.1.3.1.1 电泳仪，备电泳槽。
4.1.3.1.2 分析天平（万分之一）。
4.1.3.1.3 紫外透光分析仪。
4.1.3.2 实验步骤
4.1.3.2.1 pUC19 质粒反应
4.1.3.2.1.1 在测试管里先后加入4μLpUC19 质粒 DNA（1μg/μL）、14μL水、2 μL酶，振荡器混匀，水浴1 h。
4.1.3.2.1.2 在对照管里先后加入4 μL pUC19 质粒 DNA（1 μg/μL）、16 μL水，振荡器混匀，水浴1h。
4.1.3.3 电泳
1%～1.5%琼脂糖凝胶，电泳电压5V/cm～10 V/cm，当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。
4.1.3.4 结果判定
在电泳板上，肉眼观察。若测试管和对照管的谱带一致，则判定样品中不含有内切酶；若不一致，则判定样品中含有内切酶。
4.1.4确定逆转录酶核酸内切酶质量标准及验收指标
4.1.4.1 外观
澄清透明的液体，无沉淀。
4.1.4.2 酶活力
按4.1.1的要求检查，酶活力≥200 U/μL。
4.1.4.3 杂质
按4.1.2和4.1.3的要求检查，不应含有核酸外切酶和核酸内切酶。
4.1.5逆转录酶核酸内切酶的选择
按上述要求检测结果如下：


结论：在其他指标满足要求的前提下，B厂家酶活力更好，选择B厂家作为供应商，A厂家作为备用供应商。
4.2 TaqDNA聚合酶的选择及质量标准的制定

4.2.1 制定TaqDNA聚合酶活性的检测方法
A.1 仪器设备
全自动医用PCR 分析系统。
A.2 试剂
A.2.1 发夹型寡核苷酸序列（T2），序列为：
5'-tagcgaaggatgtgaacctaatcccTGCTCCCGCGGCCGatctgcCGGCCGCGGGAGCA-3'
A.2.2 dNTP。
注：包括 dCTP、dATP、dTTP、dGTP。
A.2.3 PicoGreen 染料。
A.2.4 Lambda DNA标准品。
A.3 试剂溶液配制
A.3.1 1×TE溶液：10mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA·2Na，pH 8.5（25 ℃）。
A.3.2 PCR buffer：250 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L(NH4)2SO4，500 mmol/L KCl，1%（体积分数）Tritonx-100，pH8.5（25℃）。
A.3.3 Lambda DNA预染液：以8.5 μL：1 μL：0.5 μL 的比例分别量取纯化水、10×PCR buffer 和PicoGreen染料加入EP管；在漩涡混匀器上振荡混匀1 min后在微型离心机上离心数秒.储存干 2℃～8℃。
A.3.4 MgCl2。溶液：25 mmol/L MgCl2·6H2O。
A.3.5 酶稀释缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA·2Na，1 mmol/L DTT.50 %（体积分数）甘油.pH8.0（25℃）。
A.3.6 T2溶液：将发夹型寡核苷酸序列（T2）干粉按照合成单上的说明稀释到100 μmol/L，储存于-20℃。使用时从-20 ℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上混匀 10 s；在微型离心机上离心数秒。
A.3.7 dNTP混合液：将dNTP中的 dCTP、dATP、dTTP、dGTP等体积进行混合，于漩涡混匀器上混匀 10 s，在微型离心机上离心数秒，配制成浓度为 25 mmol/L的 dNTP混合液。
A.3.8 Lambda DNA标准品溶液：使用1×TE溶液将 Lambda DNA标准品进行 4倍连续梯度稀释，得到 100 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.125 μg/mL、1.562 5 μg/mL 和0.781 25 μg/mL 8个浓度梯度溶液，以相同体积的1×TE溶液作为背景对照。各梯度溶液和背景对照分别加入等体积的预染液，于漩涡混匀器上混匀10 s，在微型离心机上离心数秒，以 20 μL/管分装于PCR八联管内，每个梯度3个重复，盖紧管盖，在微型离心机上离心数秒后备用。
A.3.9 Taq DNA聚合酶梯度稀释溶液：根据标定的酶比活力，使用酶稀释缓冲液对 Taq DNA聚合酶进行适当稀释（如标定浓度为5000 U/mL，即5U/uL。则可 2倍稀释，得到2×、4×，8×，16×的梯度稀释液）。该步骤应在冰上进行。
A.4 实验步骤
A.4.1聚合反应液的配制与分装
A.4.1.1在 EP管中按照表 2 的比例配制聚合反应液（冰上配制）聚合反应液配制完成后；在漩涡混匀器涡旋混匀10 s，微型离心机离心数秒。
注∶配制总体积计算见式（2）：
总体积 =[3×（n＋1）+1]×V.......…(A.1)
式中∶
3 —重复次数；
n —Tag DNA聚合酶稀释梯度；
1 —前一个"1"表示空白对照数.后一个"1"表示预留损失数量；
V1—1个反应用量，见表2。
表2聚合反应液配比


A.4.1.2 将A.4.1.1中的聚合反应液平均分装到n个（n为 Taq DNA的稀释梯度数）EP管中，分别加入 1.3 μL 的各浓度梯度的 Taq DNA聚合酶梯度稀释溶液和空白对照（酶稀释缓冲液），在漩涡混匀器涡旋混匀10 s，微型离心机离心数秒。各管混合液以20 μL/管，分装于PCR八联管内，每管混合液3个重复，盖紧管盖，在微型离心机上离心数秒后备用。
A.4.2 运行程序
在全自动医用PCR分析系统上设置如下温度程序∶
74 ℃ 6 s
荧光采集通道∶SYBR
120 cycles
将装有Lambda DNA标准品和聚合反应液的 PCR八联管置于全自动 PCR分析系统中，启动温度程序，开始聚合反应。
A.5 数据分析
A.5.1 Lambda DNA标准曲线的制作
使用全自动医用 PCR分析系统的软件打开数据，导出 Excel文件。
选取Excel文件中Lambda DNA 标准品和背景对照的第 30cycles 的荧光值。计算背景对照3个重复的平均荧光值，将各梯度Lambda DNA标准品的荧光值减掉背景对照的平均荧光值，得到净荧光值。计算各梯度净荧光值的平均值和标准偏差 SD。以Lambda DNA 标准品 DNA量（ng）为 X轴，以各梯度净荧光值的平均值为Y轴，标准偏差 SD为Error 值进行多项式拟合分析.制作工作曲线，从中获得净荧光值与双链 DNA浓度的关系曲线如下，R2≥0.98：
y =A+Bx……（A.2）
式中∶
y——荧光值；
x——双链DNA的量，单位为纳克（ng）。
A.5.2 聚合反应新生成的双链 DNA量的计算
选取Excel文件中待检 Taq DNA聚合酶的第30 cycles 的荧光数据。首先计算空白对照3个重复的平均荧光值，将各梯度 Taq DNA 聚合酶的荧光值减掉空白对照的平均荧光值，得到净荧光值.计算各梯度净荧光值的平均值（y1）。将各净荧光值代入式（A.1）计算聚合反应新生成的双链 DNA量(x1)。
A.5.3 各 Taq DNA 聚合酶梯度条件下的 dNTP消耗量计算
各 Taq DNA 聚合酶梯度条件下的 dNTP消耗量以y。表示，单位为纳摩尔（nmol）.按式（A.3）计算∶
y2=x1/(2×324.5)……（A.3）
式中∶
x1——新生成的双链DNA 量.单位纳克（ng）
2 —双链DNA由2 条单链 DNA组成；
324.5 —dNTP的相对平均分子质量。
A.5.4 Taq DNA聚合酶活计算
Tag DNA聚合酶酶活以S表示，单位为 U/mL。选择在0.024 nmol~0.166 nmol范围内的 dNTP 消耗量按照式（A.4）计算∶
S=（y2+0.03）×D/0.24……（A.4）
式中∶
y2——dNTP消耗量，单位纳摩尔（nmol）；
D——酶的稀释倍数。
4.2.2 制定TaqDNA聚合酶核酸外切酶活性的检测方法
B.1 原理
cccpUC19 所含经 BamH I位点居于编码Lac Z的α互补肽上，cccpUC19经 BamH I酶切后，由环形 DNA结构形成稳定的具有至黏性末端的双链 DNA.其末端突出部分由五个碱基形成单链.极易受核酸外切酶作用。若样品存在核酸外切酶时，黏性末端易受外切酶切割，再经 T4DNA 连接酶连接，其电泳条带位置不一致。
B.2 仪器和设备
B.2.1 恒温水浴槽。
B.2.2 台式离心机。
B.2.3 超净工作台。
B.2.4 电泳仪。
B.3 材料
B.3.1 高纯ccc pUC19 DNA。
B.3.2 T4 DNA连接酶。
B.3.3 氯仿-异戊醇（24:1，体积比）。
B.3.4 琼脂糖。
B.4 实验步骤
B.4.1 长时程过量酶切
各取5 μg 高纯 ccc pUC19 DNA 置于两只 eppondorf 管，分别标记阴性对照和测试管，在阴性对照管里加入 10 μL 10×BamH I缓冲液.2 μL 限制性内切酶 BamH I（10 U～20 U），加入纯化水至100 μL；在测试管里加入 10 μL 10×BamH Ⅰ缓冲液，2 μL 限制性内切酶 BamH I（10 U～20 U），5 μL TaqDNA聚合酶样品（50 U～100 U），加入纯化水至 100 μL。混匀，37 ℃水浴 10 h，各取出20 μL，分别标记1,2号，待电泳检测；再各取20 μL，分别标记3,4号。
B.4.2 电泳
B.4.2.1 取出1号和2号管，加入载样缓冲液，准备电泳检测。
B.4.2.2 1%～1.5%琼脂糖，电冰电压5 V/cm～10 V/cm；当浪酚蓝线到达凝胶板 2/3时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。
B.4.3 连接
B.4.3.1 回收 DNA
取出3、4号管，各加入 20 μL氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白，再沉淀出 DNA，并真空干燥样品。
B.4.3.2 连接反应
每管加入2 μL 10×T4 DNA连接酶缓冲液，2 U T4 DNA连接酶，加入纯化水至20 uL，混匀，15℃水浴8 h。
B.4.3.3 电泳
B.4.3.3.1 取出3号和 4号管，加入载样缓冲液，准备电泳检测。
B.4.3.3.2 1%～1.5%琼脂糖；电泳电压5V/cm~10 V/cm；当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。
B.5 结果判定
在电泳板上，肉眼观察。若1号和2号的谱带一致，3号和4号的谱带一致，则判定样品中不含核酸外切酶；若1号和2号的谱带不一致或（和）3号和4号的谱带不一致.则判定样品中含核酸外切酶。
4.2.3 制定TaqDNA聚合酶核酸内切酶活性的检测方法
C.1 原理
pUC19质粒为环状结构，核酸内切酶能破坏环状结构，两者电泳谱带不一致。
C.2 仪器
C.2.1 电泳仪。
C.2.2 分析天平（万分之一）。
C.2.3 紫外透光分析仪。
C.3 实验步骤
C.3.1 pUC19 质粒反应
C.3.1.1 在测试管里先后加入4 μLpUC19质粒DNA（1μg/μL）、14 μL纯化水、2 μL 酶，振荡器混匀，水浴1h；
C.3.1.2 在对照管里先后加入4 μL pUC19质粒 DNA（1 μg/μL）、16 μL 纯化水，振荡器混匀，水浴1 h。
C.3.2 电泳
1%～1.5%琼脂糖凝胶，电泳电压5 V/cm～10 V/cm，当溴酚蓝线到达凝胶板 2/3时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照。
C.4 结果判定
在电泳板上，肉眼观察。若测试管和对照管的谱带一致，则判定样品中不含核酸内切酶；若不一致，则判定样品中含有核酸内切酶。
4.2.4确定TaqDNA聚合酶质量标准及验收指标
4.2.4.1 外观
澄清透明的液体，无沉淀。
4.2.4.2 酶活力
按4.2.1的要求检查，酶活力≥200 U/μL。
4.2.4.3 杂质
按4.2.2和4.2.3的要求检查，不应含有核酸外切酶和核酸内切酶。
4.2.5TaqDNA聚合酶的选择
按上述要求检测结果如下：


结论：在其他指标满足要求的前提下，C厂家酶活力更好，选择C 厂家作为供应商，A厂家作为备用供应商。
4.3 DNA引物及探针的选择及质量标准的制定

4.3.1 制定DNA引物及探针的检测方法
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，水为 GB/T 6682规定的一级水。
4.3.1.1 外观及性状
感官判断。
4.3.1.2 合成 DNA 的总量检测
4.3.1.2.1 测定吸光度
利用紫外分光光度计测定合成DNA产品的 OD，利用吸光度 A 等于1为1OD单位来计算合成DNA产品的总量。重复测定3次，结果取平均值。
4.3.1.2.2 试验方法
按照GB/T30988执行。
4.3.1.3 核酸引物探针相对分子质量的检测
4.3.1.3.1 相对分子质量的直接计算
相对分子质量可根据引物探针合成单.按照下式直接计算。
MW=(A×313.21)+(C×289.18)+(G×329.21)+(T×304.19)-61.94
式中∶MW
—相对分子质量;
A、C、G、T—各碱基对应的碱基数。
注：计算探针相对分子质量时，应加上相应的修饰基团相对分子质量。常见修饰基团相对分子质量参见GB/T34797表A.1。
4.3.1.3.2 质谱测定相对分子质量
采用ESI源电离喷雾技术，负离子模式将样品转化为运动的带电气态离子碎片，按质核比（m/z）大小分离并记录，通过换算测得相对分子质量。HPLC和 MS的设备及流动相参数参见GB/T34797附录 B。
4.3.1.3.3 测定结果
采用4.3.1.3.2方法测得的相对分子质量与4.3.1.3.1中计算的相对分子质量相对误差应小于或等于0.05%。
4.3.1.4 碱基准确性检测
产品序列和定制引物或定制探针序列的匹配程度，此序列由合成仪后台自动生成并验证。
4.3.1.5 碱基缺失率
通过质谱联用仪对合成的寡核苷酸序列进行测定，计算扣除目标峰以外的其他峰高占所有峰高的比值。
4.3.1.6 引物探针的纯度检测
4.3.1.6.1 质谱法
采用6.3.2 的方法测定，计算目标峰面积占所有峰面积比值得出纯度。
4.3.1.6.2 高效液相色谱法
采用高效液相色谱进行纯度测定，具体条件参见GB/T34797附录B，计算峰面积，并与对照进行比较，得出引物探针纯度。纯度应符合表3的要求。
4.3.1.7 探针修饰基团的准确性
4.3.1.7.1 质谱法
采用6.3.2的方法测定，通过比较相对分子质量来确定是否含有定制探针的修饰基团。
4.3.1.7.2 荧光光谱法
采用荧光光谱仪，固定激发波长，并以激发波长为起始点对发射波长进行扫描（起始点至 900 nm），验证修饰基团的准确性。对应修饰基团的特征吸收峰参见GB/T34797表C.1。
4.3.1.8 引物探针验证
4.3.1.8.1 总则
选择目标产品 DNA作为阳性对照，以非目标产品 DNA作为阴性对照：以灭菌去离子水为空白对照，进行 PCR 扩增（或实时荧光 PCR）试验，根据扩增结果判断试验效果。特异性验证试验应符合GB/T19495.1 的要求。
4.3.1.8.2 特异性和符合性判断
根据扩增图谱查看是否获得特异性条带（或是否有典型扩增曲线）。获得特异性条带（或有典型扩增曲线），即可判断产品符合要求，引物设计合理。
4.3.1.8.3 引物二聚体带
观察 PCR 扩增产物图谱未形成明显的引物二聚体带，空白对照和阴性对照未出现扩增现象，即可判断产品质量合格，引物设计合理。
4.3.4确定引物及探针质量标准及验收指标
4.3.4.1DNA引物探针产品质量控制指标及技术要求应符合表3的规定。
表3 DNA引物探针产品质量技术要求


4.3.4.2 外观及性状
产品应为半透明或不透明的片状粉状物质、无异味，易溶于水和 TE 缓冲液。
4.3.4.3 引物探针的总量
引物探针的总量一般以OD来表示，合成产品OD测量值与定制序列OD值作比较，要求总量相对误差≤10%。
4.3.4.4 引物探针的相对分子质量
测得的引物探针相对分子质量（MW）与定制序列 MW 值作比较;要求相对分子质量相对误≤0.05%。
4.3.4.5 碱基准确性（DNA序列的一致性）
将合成的引物探针序列与定制序列进行比对，匹配度应达到100%。
4.3.4.6 碱基缺失率
合成产品碱基缺失率应符合表3要求。
4.3.4.7 引物探针的纯度
引物探针纯度主要级别分为"脱盐"级、"过柱"级、PAGE 级、HPLC级，应满足表3要求。
4.3.4.8 探针修饰基团的准确性
探针修饰基团定制序列应完全一致。
4.3.4.9 试验效果评估
将合成以后的引物探针进行PCR扩增以对其试验效果进行评估，应有特异性条带（或有典型扩增曲线），观察 PCR扩增产物图谱未形成明显的引物二聚体带，空白对照和阴性对照未出现扩增现象，即可判断产品质量合格，引物设计合理。
4.3.5DNA引物及探针的选择
4.3.5.1审查供应商合成报告单，满足要求。
4.3.5.2用欧盟Certified Reference Materials:ERM®-AD623a， ERM®-AD623b，ERM®-AD623c，ERM®-AD623d， ERM®-AD623e，ERM®-AD623f（plasmid DNA containing a BCR-ABL b3a2 transcript fragment）进行验证。
标准物质浓度如下：


质粒图谱如下：




结论：在其他指标满足要求的前提下，A厂家灵敏度更高，选择A 厂家作为供应商。
4.4质控品原料选择及质量标准的制定

4.4.1实验目的：确定合适的BCR/ABL和ABL细胞系。
4.4.2 试验仪器
仪器：离心机、移液器、低温高速离心机、恒温水浴锅、数字 PCR 仪(型号：QX200 droplet reader, IVD)，BIO-RAD公司生产；
4.4.3 耗材与试剂
耗材：1000ul枪头、200ul枪头、10ul枪头、EP管。
试剂：美国Bio-Rad的BCR-ABL数字PCR法试剂盒（QXDx BCR-ABL %IS Kit），不同厂家的K562细胞系，HL60细胞系。
4.4.4质量标准：K562细胞系融合基因浓度：＞40%IS，HL60细胞系细胞系融合基因浓度：＜0.002%IS。
4.4.4 实验步骤
将K562细胞系、KL60细胞系按试剂盒的要求提取RNA，反转录，数字PCR反应并进行数据分析结果如下：
K562细胞系检测结果如下：


BCR-ABL阴性细胞系检测结果如下：


结论：从结果看，A、C公司的K562细胞系、KL60细胞系均满足质量标准，由于A公司K562细胞系融合基因mRNA浓度最高，将其作为原料供应商。
五、 原材料研究总结

综上所述：
反转录酶选择选择****公司；引物和探针选择****公司；TapDNA聚合酶选择****公司；K562细胞系、KL60细胞系选择****有限公司。
详细原材料清单请见附件1。
附件1： 原材料清单

序号	原辅料名称
1	逆转录酶（c-MMLV酶）
2	反转录酶
3	RNasin
4	逆转录引物：随机六核苷酸引物
5	热启动TaqDNA聚合酶
6	BCR-ABL 引物和探针
7	ABL 引物和探针
8	去核酸酶水
9	K562 cells
10	HL60 cells

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