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免疫荧光技术,融合了免疫学、生物化学与显微镜技术的精髓,是一项创新的技术手段。它基于抗原抗体特异性结合的原理,将已知的抗原或抗体标记上荧光染料,再利用这种荧光标记的抗体(或抗原)作为检测工具,检查细胞或组织中的相应抗原(或抗体)。借助荧光显微镜,我们能够观察到荧光信号所在的细胞或组织,从而揭示抗原或抗体的特性与位置,并通过定量技术(如流式细胞术)测定其含量。
一、实验准备
1. 胰蛋白酶
2. BI细胞培养液图像
3. BI血清
4. 细胞培养12孔或6孔板
5. 爬片
二、实验操作步骤
1. 细胞铺板与爬片制备:荧光显微镜直接拍摄培养皿中的细胞并无太大难度,但制备爬片效果更佳,既提升成像质量,又便于共聚焦拍摄,且可冷冻保存以备后用。爬片预处理需涂布多聚赖氨酸以增强细胞附着性。
(1)将多聚赖氨酸均匀涂布于爬片上,静置30至120分钟。
(2)随后用无菌超纯水清洗并浸泡。
(3)自然干燥后,置于紫外线下照射至少1小时。若爬片已高温灭菌,照射时间可适当缩短。
(4)若使用普通盖玻片而非专用细胞爬片,建议先用0.1% Tween-20的PBS清洗,以去除杂质。
(5)在培养皿中滴加约100微升培养液,然后将爬片贴上,确保贴合紧密且无气泡。
(6)进行常规细胞培养。若细胞贴壁能力强,如胰蛋白酶消化需3分钟以上,则可省略第一步。
2. 细胞固定与免疫荧光染色
(1)吸去培养液,用PBS清洗细胞3次,每次5分钟。
(2)加入1毫升4%多聚甲醛,室温固定20分钟。
(3)吸去多聚甲醛,用PBS清洗3次,每次5分钟。
(4)加入0.5% Triton X-100(PBS配制),室温通透20分钟,以增加细胞通透性。
(5)吸去Triton X-100,用PBS清洗3次,每次5分钟。
(6)用10%与二抗同源的山羊血清(PBS配制)或5% BSA封闭2小时。封闭液应与后续抗体稀释液一致。封闭后无需用PBS清洗。
(7)吸去封闭液,向每孔加入足量适当浓度的一抗(首次使用抗体可参考抗体说明书推荐浓度,后续实验可根据实际情况调整),置于4℃湿盒内孵育过夜。
(8)吸去一抗,用PBS清洗3次,每次5分钟。
(9)向每孔加入足量适当浓度的二抗,37℃室温避光孵育1小时。注意二抗带有荧光标记,操作过程应尽量在暗处进行。
(10)吸去二抗,用PBS清洗3次,每次5分钟。
(11)向玻片上滴加DAPI或Hoechst染液复染细胞核,一般呈现蓝色荧光;避光孵育5至10分钟。图像
(12)用PBS轻轻清洗细胞3次,每次5分钟,以去除多余的DAPI。
(13)取爬片时,由于爬片与培养皿底结合紧密,张力较大,可用注射器针头针尖在背面做一个小钩,轻轻勾起爬片,再用小镊子取出。
(14)用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。注意将爬片反转贴于多聚赖氨酸载玻片上,然后在荧光显微镜下观察并采集图像。需根据抗体选择相应的激发光源。
三、操作注意事项
1. 取细胞爬片时,动作需轻柔,以免夹碎爬片,影响实验进度。
2. 在种细胞过程中,应轻柔混匀细胞,以“八”字或“十”字形摇晃,避免细胞局部过密。
3. 在稀释、加入二抗(荧光抗体)及后续洗涤过程中,需注意避光。
4. 细胞爬片进行免疫荧光染色后,应尽快拍照,以免免疫荧光淬灭。或置于暗盒内,暂时保存于4℃冰箱,并尽快完成拍照。
5. 在使用荧光显微镜拍照时,需根据荧光抗体选择合适的激发光源。PI/DAPI可将凋亡和未凋亡的细胞均染成红色/蓝色,而仅在凋亡细胞核中有FITC-12-dUTP掺入并呈现绿色荧光。
四、总结
要获得一张完美的免疫细胞荧光图像,从爬片制备、固定液选择、通透方式到抗体浓度的确定,每一个环节都至关重要。无论哪种实验,都需要通过反复熟悉实验步骤和优化条件,才能最终取得理想的实验结果。
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