质谱分析技术详细讲解

千姿百态

质谱，物质的分子在高真空下，经物理作用或化学反应等途径形成带电粒子, 某些带电粒子可进一步断裂，形成离子，每一离子的质量与所带电荷的比称为质荷比(m/z,曾用m/e)，不同质荷比的离子经质量分离器一一分离后，由检测器测定每一离子的质荷比及相对强度，由此得出的谱图称为质谱。
一、不同离子的概念
1、分子离子分子被电子束轰击失去一个电子形成的离子称为分子离子。分子离子用 M+表示。分子离子是一个游离基离子。在质谱图中与分子离子相对应的峰为分子离子峰。分子离子峰的质荷比就是化合物的相对分子质量, 所以,用质谱法可测分子量。
2、同位素离子含有同位素的离子称为同位素离子。在质谱图上,与同位素离子相对应的峰称为同位素离子峰。
3、碎片离子分子离子在电离室中进一步发生键断裂生成的离子称为碎片离子。
4、重排离子经重排裂解产生的离子称为重排离子。其结构并非原来分子的结构单元。在重排反应中，化学键的断裂和生成同时发生, 并丢失中性分子或碎片。
5、奇电子离子与偶电子离子具有未配对电子的离子为奇电子离子。这样的离子同时也是自由基，具有较高的反应活性。无未配对电子的离子为偶电子离子。
6、多电荷离子分子中带有不止一个电荷的离子称为多电荷离子。当离子带有多电荷离子时，其质核比下降，因此可以利用常规的四极质量分析器来检测大分子量化合物。
7、亚稳离子从离子源出口到检测器之间产生的离子。即在飞行过程中发生裂解的母离子。由于母离子中途已经裂解生成某种离子和中性碎片，记录器中只能记录这种离子，也称这种离子为亚稳离子，由它形成的质谱峰为亚稳峰。
8、准分子离子比分子量多或少 1 质量单位的离子称为准分子离子，如：(M+H)+， (M-H)+。其不含未配对电子，结构上比较稳定。
二、分子离子峰
1、分子离子峰强度分子离子是质谱图中最有价值的信息，它不但是测定化合物分子量的依据，而且可以推测化合物的分子式，用高分辨质谱可以直接测定化合物的分子式。
一般来讲，从分子中失去的电子应该是分子中束缚最弱的电子，如双键或叁键的π电子，杂原子上的非键电子。
分子离子的丰度主要取决于其稳定性和分子电离所需要的能量。易失去电子的化合物，如环状化合物、双键化合物等，其分子离子稳定、分子离子峰较强；而长碳链烷烃、支链烷烃等正与此相反。
各类化合物分子离子稳定性次序大致为：芳香环(包括芳香杂环)>共轭烯>烯>脂环>硫醚、硫酮>酰胺>酮>醛>直链烷烃>醚>酯 >胺>羧酸>腈>伯醇>仲醇>叔醇>高度支链烃。
芳环 (包括芳杂环) 、脂环化合物、硫醚、硫酮、共轭烯分子离子峰比较明显，直链酮、酯、酸、醛、酰胺、卤化物等通常显示分子离子峰，脂肪族醇、胺、亚硝酸酯、硝酸酯、硝基化合物、腈类及多支链化合物容易裂解, 分子离子峰通常很弱或不出现。分子离子峰不出现或丰度极低难以确认，可根据不同情况改变实验条件予以验证。
（1）降低轰击电子的能量将常用的70eV 改变15eV 以减少形成的分子离子继续断裂的几率，降低了碎片离子的丰度，使分子离子峰的相对丰度增加，从而可能辨认出分子离子。
（2）用CI, FI, FD等软电离方法降低轰击电子能量的结果会使仪器的灵敏度下降，虽然分子离子峰的丰度有所提高，但离子的绝对强度降低，一些由于热不稳定和低挥发性等原因而不出现分子离子峰的化合物，用这种办法不会得到预期的效果，这时可采取各种软电离的办法，虽然碎片离子大量减少，但可以突出分子离子峰。
（3）降低样品的气化温度气化温度的降低可以减少分子离子进一步断裂的可能性，分子离子峰的相对丰度增加。如三十烷烃在340℃时气化，不出现分子离子峰，改变70℃气化时分子离子峰的丰度接近基峰。
（4）制备衍生物某些化合物不易挥发或热稳定性差，可以衍生化处理。例如，可将某有机酸制备成相应的酯，酯容易气化，而且易得到分子离子峰，由此来推断有机酸的分子量。
2、分子离子峰的识别解析时一般把谱图中最高质荷比的离子假设为分子离子，后用分子离子的判别标准一一对比，若被检查离子不符其中任何一条标准，则它一定不是分子离子；若被检查离子符合所有条件，则它有可能是分子离子。分子离子的判别可以参考如下标准：
（1）分子离子必须是奇电子离子。由于有机分子都是偶电子，所有失去一个电子生成的分子离子必是奇电子离子。
（2）是否符合氮规则 (Nitrogen Rule) 。有机化合物的分子量是偶数或奇数与所含有的氮原子的数目有关。凡不含氮原子或含偶数个氮原子的化合物，其分子量必为偶数；含奇数个氮原子的化合物，其分子量必为奇数，这就是所谓的氮规则。
（3）合理的中性碎片的丢失。这些中性碎片可能是小分子或者自由基基团。这些中性碎片有着特殊的质量数，m/z最高值与邻近的碎片离子之间应有一个合理的质量差。
例如：M+丢失一个质子H、CH3、H2O,C2H4等是合理的。如果这个质量差落在4~14和21~25之间就是不合理的，也即如果在M-4到M-13的范围内存在峰，则说明原所假定的分子离子峰不是分子离子峰。
三、碎片离子
碎片离子的质荷比及其丰度在质谱数据中占很大比例。碎片离子的相对丰度与分子结构有密切关系，高丰度的碎片峰代表分子中易于裂解的部分，如果有几个主要碎片峰，并且代表着分子的不同部分，则由这些碎片峰就可以粗略地把分子骨架拼凑起来。质谱解析的大量工作就是分析碎片离子的形成过程。
1、α断裂分子失去电子，形成游离基离子，它的电子有强烈的成对倾向，电子转移与邻近原子形成一个新键，同时邻近原子的α键断裂。因此，这种断裂通常称为“α”断裂反应。
（1）饱和杂原子：杂原子的孤对电子电离能较低，很容易去失，形成游离基离子，进而发生α断裂，如：


（2）不饱和杂原子：例如羰基化合物的α断裂过程如下：


（3）烯烃类的烯丙位裂解：


上述反应的进行与游离基中心给电子倾向有密切的关系。氮原子给电子能力很强，α断裂在脂肪族胺中占主导地位，其次是氧族元素，由给电子能力的差别造成的α断裂反应的难易程度按下列顺序排列：N>S、O、π，R>Cl、Br>H。当一个化合物有几个α键时，最容易去失的是最大的烷基游离基。


2、i断裂（诱导断裂）诱导断裂是由正电荷诱导、 吸引一对电子而发生的断裂, 其结果是正电荷的转移。诱导断裂常用i来表示。一般情况下，电负性强的元素诱导力也强。在有些情况下，诱导断裂和α断裂同时存在。由于i断裂需要电荷转移，因此，i断裂不如α断裂容易进行。
表现在质谱中，相应α断裂的离子峰强，i断裂产生的离子峰较弱。例如乙醚，i断裂和α断裂同时存在，α断裂的几率大于i断裂。但由于α断裂生成的m/z 59还有进一步的断裂，因此在乙醚的质谱中，m/z59并不比m/z 29强。


3、σ断裂如果化合物分子中具有σ键，如烃类化合物，则会发生σ键断裂。σ键断裂需要的能量大，当化合物中没有π电子和n电子时，σ键的断裂才可能成为主要的断裂方式。断裂后形成的产物越稳定，这样的断裂就越容易进行，阳碳离子的稳定性顺序为叔>仲>伯。因此，碳氢化合物最容易在分支处发生键的断裂。并且，失去最大烷基的断裂最容易进行。


4、重排开裂 重排开裂时涉及到两个键的断裂，脱去一个中性分子，同时发生H重排。重排的结果产生了在原化合物中不存在的结构单元的离子。
（1）麦氏重排(Mclafferty rearrangement)分子离子或碎片离子结构中有双键，且在γ位上有H原子的正离子都能发生麦氏重排。在开裂中，γ位上的H通过六元环过渡态的迁移到电离的双键碳或杂原子上，同时烯丙键断裂，生成中性分子和碎片离子。


醛、酮、羧酸、酯、酰胺、碳酸酯、磷酸酯、肟、腙、烯、炔以及烷基苯等的含有γ-H的有机化合物很容易发生麦氏重排。
（2）逆迪尔斯一阿尔德重排(retro Diels-Alder fragmentation,RDA)对具有环内双键结构的化合物能发生RDA开裂，一般生成一个带正电荷的共轭二烯自由基和一个中性分子。
（3）脱去小分子化合物的重排在一些醇类、硫醇类、卤代烃等有机化合物分子的质谱中经常出现脱去水、硫化氢、卤化氢等小分子化合物而生成的碎片离子。醇非常容易脱去水分子，所以醇类化合物的分子离子峰相对丰度很小，甚至不出现分子离子峰。
（4）复杂开裂复杂开裂是指在有机化合物的质谱中，经常出现离子中两个或两个以上化学键连续发生断裂生成碎片的过程。除了重排反应以外，环状化合物的质谱碎裂也是如此。复杂断裂一般是指环状化合物发生的多个键断裂，有时涉及一个氢原子的转移。


（5）骨架重排骨架重排是指在有机化合物裂解过程中，部分基团如甲基、芳香基以及含O、N、S等的基团发生迁移，生成一些小的中性碎片、自由基离子等的过程。常见的中性碎片如CO、SO、SO2, S2, CH=CH等。如蒽醌发生芳基迁移，存在下列裂解：


四、质谱常见问题解析
1、质谱不出峰的可能原因？
解析：
1）进样系统与离子源没连接或有漏液

2）六通阀漏液
3）雾化气没开
4）喷雾电压没有
5）离子进入分析器的离子通道堵塞
6）喷雾毛细管堵塞
2、如何根据样品选择离子源？
解析：
可根据分子量的大小、极性。APCI适合小分子，极性小的化合物；ESI适合分析的分子量范围较大、分子要求带有一定极性。一般先考虑用ESI分析，如果极性实在太小，才想到用APCI。
3、等度还是梯度洗脱如何选择？
解析：
其实只做一两个化合物，是等度洗脱好，速度快，但也并非越快越好，特别在分析生物样品时，考虑到基质效应，保留因子控制在2-3左右较好。梯度洗脱适合分析多个结构不同的物质，如化合物与代谢产物一同鉴定的时候，比如苷和苷元的一同测定。另外很多做合成化学的分析实验室用的也是一通用的梯度洗脱方法，一个方法搞定大部分样品。一般来说对于组成简单的样品可以采用等度洗脱，而对于那些复杂的样品分离通常需要进行梯度洗脱。
4、气质和液质系统对比？
解析：
除了采用的分离手段不同（气相和液相）外主要的区别在于真空系统和电离方式。气质的真空系统比较简单，只要一个小的机械泵和一个分子涡轮泵就可以了。液质的机械泵要比气质大，需要两个分子涡轮泵。气质的电离方式有电子电离(EI)和化学电离(CI)。液质的电离方式有电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)和大气压光电离(APPI)。
5、APCI和ESI的不同点？
解析：
1）离子产生的方式不同。APCI利用电晕放电离子化，气相离子化。ESI利用离子蒸发，液相离子化。
2）能被分析的化合物类型不同。APCI适合弱极性，小分子化合物，且具有一定的挥发性；ESI 极性化合物和生物大分子。
3）流速不同。ESI一般流速较小，约0.001到0.25 mL/min，APCI 相对较大，约0.2到2 mL/min。
4）多电荷。APCI不能生成一系列多电荷离子，所以不适合分析大分子；ESI 能生成一系列多电荷离子，特别适用于蛋白，多肽类等生物分子。
6、CID和CAD区别？
解析：
CID，碰撞诱导解离。通常在真空接口处调节电压发生CID现象，一般是去除溶剂，如果电压增大，也会产生碎片离子。这是一级质谱的原理。CAD碰撞活化解离。做二级质谱时，选择的母离子进入Q2后，碰撞活化产生子离子，这个过程称为 CAD。以API3200谱仪为例，CID指的是Q0里面的诱导碰撞的气体，CAD指的是Q3里面的诱导碰撞气体。也就是说，在这里的CID&CAD都是指氮气。
7、氮气发生器该使用吗？
解析：
氮气发生器的工作原理是分离空气，电解膜的负极侧发生氧化反应，“吃掉”空气中的氧化性气体，在正极侧还原，空气流过电解池后就只剩下氮气和惰性气体。故国内发生器的纯度大多标有“相对含氧量”。氮气的纯度和空气流速、有效分解面的长度、电解电势的强弱都有关系。这种分离方法也决定了氮气的纯度不可能做的很高。加入电解质的作用就是提高水的导电率，使电化学反应能顺利进行。发生器对质谱的影响有一点常常被忽略，就是发生器内的开关电源工作时会对电网电压造成一定的干扰（压缩机的启动和停止也会）。
8、串联质谱如何定量？
解析：
串联质谱定量时,是以后面产生的碎片峰（子离子）定量。但是这一子离子是由母离子在碰撞室产生的特征性碎片，所以用MRM定量灵敏度会比用SIM定量好很多。建立方法的步骤是：用一定溶度的标准品溶液（1-10 ug/mL）调谐化合物的一级质谱条件，找到母离子的最佳质谱条件。然后对母离子进行打碎，优化碰撞能量，得到其特征性的子离子。最后利用该质谱条件和该母离子->子离子对进行定量。
9、质量偏差怎么办？
解析：
质谱的质量数偏了，说明你的仪器该校正了，一般3个月就要校一次机。一般每个厂家都会随机带有校正液。
10、如何更换机械泵油？
解析：
一般3个月到半年更换一次泵油，可同时停机对仪器进行一次清洗。更换泵油的时候，先开启振气阀5-10分钟，待将泵内沉淀振起后，关闭振气阀，同时关闭电源。打开泵下的泵油排放阀门，放掉旧油。如果泵油已经很脏，则可取少许新油清洗泵后放掉再注入新油。
11、产生碰装室离子交互影响（Collision Cell Cross Talk）的原因及消除？
解析：
多通道扫描（MRM）时，如果两个离子扫描通道的碎片离子一样（或类似如相差1-2分子量单位），前一个离子通道扫描结束后，碰装室里的离子来不及清除，影响下一个离子通道反应的定量（如果色谱分离完全则无此影响）。
可能的消除方法：
1）选择特异的子离子（特别是在用稳定同位素内标时）
2）增加离子通道扫描反应之间的时间间隔（如100 ms→300 ms）
3）可设置额外的“无用的离子扫描通道（dummy MRM）”
12、排除色谱柱流失问题的最佳方法是什么？
解析：
诊断色谱柱是否存在流失问题的方法是第一次在方法条件下安装色谱柱时，做一次空白色谱图，然后将最近的运行和空白运行色谱图对比。如果在空白运行中产生了很多峰，则色谱柱性能改变，这可能是由于载气中含有氧气，也可能是由于样品残留。如果有 GC-MS，则低极性色谱柱的典型流失离子（例如 DB/HP-1或5）质/荷比m/z 将为 207、73、281、355 等，大多数为环硅氧烷。
13、谱图为什么只有溶剂峰？
解析：
可能有以下原因
1）进样针损坏
2）载气流速太低
3）样品浓度太低
4）样品被柱或进样器衬套吸附
14、质谱基线高是什么原因？
解析：
质谱的基线其实跟液相的紫外检测器和荧光检测器一样，基线高的原因不外乎内部和外部的原因。
1）选择的流动相在质谱的响应比较高，比如水相比较多的时候，噪音比较大些；还有如果盐含量比较大的时候，噪音更大些。
2）检测器的灵敏度越高的时候，噪音应该越高。如果质谱的污染比较严重时，基线肯定比较高。比如离子阱检测器，用得久了，阱中的离子就会增多，一方面降低了质谱的灵敏度，另一方面增加了基线噪音。
3）质谱的基线很多时候还跟你选择的离子宽度有关。比如作选择离子扫描的时候，基线就低些。作选择反应扫描的时候，离子宽度不要选得太宽，太宽噪音就高些。
4）多级质谱一般做二级或三级质谱，基线噪音就低很多。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/634071321