新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（免疫层析法）主要原材料研究资料

John

新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（免疫层析法）主要原材料研究资料
目录
一、概述
二、新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（免疫层析法）检测原理及相关信息
2.1检测原理
2.2新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（免疫层析法） 产品信息
2.3新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（免疫层析法） 组分
三、 主要原料来源及供应商选择的研究资料
3.1 金标记用抗体及T线抗体
3.2兔IgG和C线羊抗兔抗体
3.3NC膜
3.4氯金酸
3.5玻璃纤维
3.6样品垫
3.7吸水纸
四、 原材料来源的确定
五、 原材料质量标准的确定
六、 企业参考品制备
主要原材料研究资料
提交申报产品主要原材料的研究资料，内容包括主要原材料的来源、选择、制备方法的研究资料及其质量标准的制订资料、评价结果和质量分析证书，并详细描述原材料的技术指标和验收标准。
一、概述

2019新型冠状病毒（COVID-19），因2019年发生病毒性肺炎病例而被发现，2020年1 月12日被世界卫生组织命名。和中东呼吸综合征病毒（MERS）以及严重急性呼吸综合征病毒（SARS）都属于B冠状病毒，属于人畜共患病原体，可引起动物与人之间的感染，也可引起人与人之间的感染。
目前针对新型冠状病毒的检测方法主要有核酸检测、抗体检测和抗原检测。
抗原检测，具有诊断快速、准确、对设备和人员要求低，因此可应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等基层的早期初步筛查。但由于新型冠状病毒主要侵犯肺泡等下呼吸道，所以往往从鼻咽、口咽等上呼吸道的取样中所含病毒数量较少，而目前市场上存在的抗原检测试剂盒通常采用单一抗原特异性抗体作为检测试剂，因此容易出现对样本中的抗原（病毒蛋白）敏感性不够而造成漏检，从而出现假阴性。
因此，亟需一种更加方便快捷、准确有效的诊断新型冠状病毒抗原检测试剂盒用于早期的筛查诊断。
本报告主要是关于新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（免疫层析法）主要原材料的研究，包括该试剂盒的相关信息以及主要原料的性状、性能等的研究。
二、新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（免疫层析法）检测原理及相关信息

2.1检测原理

本试剂盒利用免疫层析技术，采用双抗体夹心法检测鼻拭子样本中是否存在新型冠状病毒( 2019-nCoV)核衣壳蛋白。当样本被处理并添加到检测卡中时，样本中的新型冠状病毒(2019-nCoV) 抗原与试纸条上用胶体金标记的抗体结合，抗原-抗体复合物穿过试纸条迁移到反应区，并被结合在膜上的抗体线捕获，当抗原抗体复合物沉积在检测装置上的检测“T”位置和控制“C”位置形成彩色线时，判定为阳性结果；当只有控制“C”位置形成一条彩色线，而检测“T”位置上没有可见的彩色线时，判定为阴性结果。如果控制“C”位置没有可见线，则检测结果无效，必须重新进行检测。
2.2新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（免疫层析法） 产品信息

包装规格：1/10/20/25/30/40/50人份/盒。
储存条件：产品最小单包装在未拆封且环境温度在4℃-35℃条件下，不受湿度和海拔影响，可保存至有效期末，最小单包装开封后，应在30分钟内使用。样本提取液开瓶后拧紧盖子，有效期为6个月。
2.3新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（免疫层析法） 组分

产品组成	主要成分	数量/规格
检测卡	PVC ，NC 膜， PF 盖， Whatsman 纸，与抗体结合的胶体金颗粒……	1/10/20/25/30/40/50件
一次性使用采样器	植绒尼龙纤维头, ABS 杆	1/10/20/25/30/40/50件
采样管	Tris-EDTA 缓冲液、DNase 和 RNase 抑制剂、防腐剂、钠离子、表面活性剂	1/10/20/25/30/40/50件
说明书	/	1份

三、主要原料来源及供应商选择的研究资料

3.1 金标记用抗体及T线抗体

3.1.1金标记用抗体
生物学来源：鼠抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体
识别位点：N蛋白104-LSPRWYFYYLGTGPEAGL-121氨基酸序列，序列比较结果显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。
3.1.2 T线抗体
生物学来源：鼠抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体，
识别位点：N蛋白99-GKMKDLSPRWYFYYL-113氨基酸序列，序列比较结果显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。
3.1.3抗体制备过程简述：
（1）以新型冠状病毒N蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原两个优势抗原表位，序列比较结果显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。
（2）为增强免疫效果并缩短单克隆抗体制备时间，将所选择的两个优势抗原表位串联，并在序列碳端加His标签，得到重组抗原氨基酸序列，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应核苷酸序列。
（3）化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体pET-32a（+），构建重组N蛋白表达载体。
（4）重组N蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，筛选得到重组蛋白表达菌株。
（5）重组蛋白表达菌株大规模培养后，经超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化重组N蛋白。
（6）重组N蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏分离淋巴细胞用来建立单链抗体scfy噬菌体展示库。
（7）将步骤（3）合成得到的核苷酸片段插入表达载体pTT5，构建重组N蛋白表达载体。
（8）重组N蛋白表达载体转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选鉴定得到重组表达质粒。
（9）重组表达质粒瞬转CHO细胞，7天后收集细胞上清，上清通过镍琼脂糖亲和层析纯化得到真核表达重组N蛋白。
（10）使用真核表达重组N蛋白对单链抗体scfv噬菌体展示库进行多轮淘选筛选最终得到能与真核表达重组N蛋白结合的单链抗体scfv序列。
（11）将scfv序列构建成完整鼠IgG1表达载体并使用HEK293F细胞表达单克隆抗体，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。
3.1.4供应商名称：A公司、B公司、C公司。
3.1.5供应商选择研究资料：
各厂家原料按生产工艺研究资料确定的方法标记金标记用抗体，T线抗体按1mg/mL配制包被液于NC膜上划线后干燥，制备过程需要的其他材料保持一致。
3.1.5.1抗体鉴定：Westernblot检测mAbs的结合特性
取1μg重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭2h，分别以制备的5个mAbs（1:1500）为一抗、HRP标记山羊抗鼠IgG（1:10000）为二抗孵育1h，最后使用ECL发光试剂盒显色，结果如下：


在相应位置出现目的条带，说明3个厂家的mAbs均能特异性识别重组N蛋白。
3.1.5.2抗体分子量测定
用SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒配制12%分离胶、5%浓缩胶。取6μg样品，加入5×SDS蛋白上样缓冲液，充分混匀后沸水煮8min，置于冰上备用。电泳槽中加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，取样品上样，先用80V电泳40min，再用120V电泳1h。SDS-PAGE胶用考马斯亮蓝染色液染色30min，加入脱色液脱色，用凝胶成像系统扫描，结果如下：


3个厂家的单克隆抗体重链分子量在50ku左右，轻链分子量在25ku左右，无明显差异。
3.1.5.3蛋白浓度的测定
3.1.5.3.1金标记抗体蛋白质浓度测定
采用BCA法测定蛋白质浓度，每个样本重复10次，与供应商标示的浓度应无显著差异。结果如下（单位：mg/mL）：

测量次数	A生物科技有限公司（3.12mg/mL）	B有限公司（4.60mg/mL）	C有限公司（6.50mg/mL）
n1	3.16	4.45	6.44
n2	3.14	4.57	6.58
n3	3.11	4.64	6.36
n4	3.28	4.59	6.53
n5	3.18	4.64	6.63
n6	3.14	4.75	6.60
n7	3.10	4.59	6.48
n8	3.17	4.65	6.55
n9	3.27	4.52	6.56
n10	3.30	4.73	6.53
标示值=	3.12	4.60	6.50
平均值=	3.185	4.613	6.526
t=	2.837	0.455	1.024
t临界=	2.262	2.262	2.262

不同厂家蛋白浓度测量结果与标示值不存在显著差异，可作为原辅材料质量标准制定依据，进一步通过其他试验筛选原料。
3.1.5.3.2T线抗体蛋白质浓度测定
采用BCA法测定蛋白质浓度，每个样本重复10次，与供应商标示的浓度应无显著差异。结果如下（单位：mg/mL）：

测量次数	A公司（3.05mg/mL）	B公司（5.30mg/mL）	C公司（7.90mg/mL）
n1	3.05	5.34	7.99
n2	3.09	5.24	7.91
n3	3.00	5.23	7.83
n4	3.13	5.28	7.87
n5	3.04	5.31	7.82
n6	3.08	5.31	8.06
n7	2.94	5.35	7.68
n8	2.93	5.29	7.83
n9	3.08	5.25	7.90
n10	3.09	5.48	7.83
标示值=	3.05	5.30	7.90
平均值=	3.043	5.308	7.872
t=	0.332	0.348	0.856
t临界=	2.262	2.262	2.262

不同厂家蛋白浓度测量结果与标示值不存在显著差异，可作为原辅材料质量标准制定依据，进一步通过其他试验筛选原料。
3.1.5.4效价测定
利用间接ELISA法测定抗体效价，重组N蛋白用PBS稀释至1μg/ml，取100μl加入ELISA板孔中作为包被抗原，同时设置空白对照和阴性对照（空白对照为包被抗原，不加一抗的处理组;阴性对照为不包被抗原，加一抗的处理组）。以250、500、1000、2000、4000、8000倍比梯度稀释的腹水作为一抗、AP标记山羊抗鼠IgG（1∶5000）为二抗分别孵育1.5h，最后在每孔中加入100μl0.2%对硝基苯磷酸二钠显色液，黑暗条件下显色30min，使用酶标仪测定OD405nm值。ΔOD405nm=（实验组OD405nm-空白对照OD405nm）/阴性对照OD405nm其值大于2倍的最大稀释倍数为mAbs（单克隆抗体）的效价。
试验方案如下：

组别	包被抗原（重组N蛋白）	鼠抗重组N蛋白（即金标记抗体或T线抗体）	AP标记山羊抗鼠IgG
阴性	0	100μL	100μL
空白	100μL	0	100μL
实验组	100μL	100μL	100μL

A生物科技有限公司金标记抗体效价测定结果如下：

重复次数	空白	阴性	1:250	1:500	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000
1	0.033	0.032	1.261	0.614	0.302	0.152	0.080	0.049
2	0.049	0.049	1.276	0.602	0.317	0.154	0.074	0.038
3	0.031	0.049	1.216	0.600	0.310	0.157	0.098	0.050
4	0.033	0.035	1.266	0.622	0.315	0.153	0.088	0.041
5	0.041	0.032	1.235	0.603	0.300	0.152	0.094	0.037
6	0.040	0.040	1.241	0.634	0.303	0.159	0.094	0.042
7	0.036	0.042	1.206	0.614	0.305	0.154	0.088	0.048
8	0.035	0.035	1.280	0.607	0.301	0.158	0.074	0.049
9	0.042	0.040	1.267	0.612	0.302	0.153	0.062	0.032
10	0.037	0.032	1.281	0.630	0.320	0.153	0.070	0.036
平均值	0.0377	0.0386	1.2529	0.6138	0.3075	0.1545	0.0822	0.0422
ΔOD405nm=	31.482	14.925	6.990	3.026	1.153	0.117

A公司T线抗体效价测定结果如下：

重复次数	空白	阴性	1:250	1:500	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000
1	0.050	0.046	1.261	0.608	0.302	0.157	0.098	0.045
2	0.042	0.031	1.251	0.608	0.306	0.153	0.076	0.048
3	0.043	0.036	1.270	0.618	0.314	0.159	0.066	0.039
4	0.038	0.031	1.250	0.619	0.302	0.158	0.092	0.049
5	0.030	0.037	1.208	0.602	0.319	0.153	0.076	0.044
6	0.038	0.041	1.212	0.618	0.309	0.154	0.080	0.043
7	0.045	0.031	1.200	0.620	0.306	0.150	0.068	0.031
8	0.035	0.043	1.203	0.628	0.308	0.155	0.070	0.049
9	0.035	0.041	1.249	0.640	0.304	0.158	0.092	0.048
10	0.048	0.043	1.225	0.634	0.319	0.152	0.078	0.046
平均值	0.0404	0.038	1.2329	0.6195	0.3089	0.1549	0.0796	0.0442
ΔOD405nm=	31.382	15.239	7.066	3.013	1.032	0.100

B公司金标记抗体效价测定结果如下：

重复次数	空白	阴性	1:250	1:500	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000
1	0.037	0.041	1.236	0.608	0.314	0.151	0.078	0.040
2	0.035	0.032	1.218	0.636	0.302	0.159	0.088	0.043
3	0.044	0.035	1.284	0.604	0.302	0.152	0.072	0.045
4	0.041	0.049	1.278	0.618	0.318	0.154	0.074	0.043
5	0.036	0.039	1.299	0.623	0.315	0.159	0.082	0.038
6	0.040	0.043	1.221	0.624	0.306	0.155	0.078	0.044
7	0.040	0.038	1.270	0.628	0.308	0.158	0.084	0.040
8	0.037	0.039	1.267	0.618	0.316	0.153	0.098	0.040
9	0.045	0.046	1.234	0.603	0.313	0.159	0.094	0.032
10	0.034	0.031	1.264	0.609	0.306	0.153	0.080	0.040
平均值	0.0389	0.0393	1.2571	0.6171	0.31	0.1553	0.0828	0.0405
ΔOD405nm=	30.997	14.712	6.898	2.962	1.117	0.041

B公司T线抗体效价测定结果如下：

重复次数	空白	阴性	1:250	1:500	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000
1	0.038	0.038	1.274	0.614	0.309	0.152	0.070	0.032
2	0.045	0.046	1.216	0.630	0.313	0.154	0.090	0.047
3	0.049	0.049	1.282	0.605	0.303	0.152	0.090	0.041
4	0.044	0.044	1.250	0.638	0.314	0.159	0.068	0.048
5	0.032	0.046	1.226	0.623	0.310	0.156	0.088	0.032
6	0.030	0.045	1.297	0.605	0.302	0.152	0.096	0.047
7	0.038	0.047	1.298	0.626	0.314	0.159	0.092	0.048
8	0.036	0.048	1.272	0.619	0.308	0.159	0.094	0.038
9	0.044	0.046	1.203	0.619	0.301	0.153	0.074	0.048
10	0.043	0.045	1.211	0.609	0.313	0.152	0.098	0.040
平均值	0.0399	0.0454	1.2529	0.6188	0.3087	0.1548	0.086	0.0421
ΔOD405nm=	26.718	12.751	5.921	2.531	1.015	0.048

C公司金标记抗体效价测定结果如下：

重复次数	空白	阴性	1:250	1:500	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000
1	0.050	0.035	1.256	0.622	0.308	0.150	0.062	0.048
2	0.042	0.038	1.259	0.605	0.305	0.158	0.078	0.037
3	0.032	0.049	1.260	0.615	0.310	0.160	0.092	0.048
4	0.032	0.032	1.221	0.624	0.319	0.153	0.076	0.037
5	0.040	0.049	1.267	0.638	0.312	0.152	0.094	0.049
6	0.041	0.043	1.204	0.625	0.316	0.156	0.070	0.043
7	0.033	0.044	1.273	0.605	0.319	0.151	0.098	0.049
8	0.034	0.041	1.210	0.634	0.317	0.158	0.080	0.040
9	0.050	0.050	1.278	0.621	0.301	0.151	0.068	0.043
10	0.044	0.049	1.219	0.620	0.315	0.159	0.090	0.048
平均值	0.0398	0.043	1.2447	0.6209	0.3122	0.1548	0.0808	0.0442
ΔOD405nm=	28.021	13.514	6.335	2.674	0.953	0.102

C公司T线抗体效价测定结果如下：

重复次数	空白	阴性	1:250	1:500	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000
1	0.030	0.047	1.295	0.634	0.304	0.158	0.086	0.048
2	0.048	0.042	1.220	0.624	0.300	0.158	0.094	0.032
3	0.042	0.048	1.233	0.622	0.307	0.157	0.066	0.042
4	0.047	0.046	1.246	0.635	0.315	0.153	0.098	0.042
5	0.037	0.032	1.209	0.611	0.306	0.159	0.074	0.034
6	0.032	0.030	1.212	0.620	0.308	0.156	0.084	0.044
7	0.044	0.034	1.286	0.622	0.308	0.158	0.062	0.047
8	0.042	0.042	1.296	0.628	0.306	0.158	0.062	0.033
9	0.039	0.045	1.212	0.622	0.313	0.158	0.088	0.046
10	0.039	0.033	1.249	0.611	0.316	0.156	0.060	0.044
平均值	0.04	0.0399	1.2458	0.6229	0.3083	0.1571	0.0774	0.0412
ΔOD405nm=	30.221	14.609	6.724	2.935	0.937	0.030

结果如图所示，mAbs都表现出与重组SARS-CoV-2 N蛋白较高的结合能力，其效价均达到2000以上，进一步通过其他试验筛选原料。
3.1.5.5低值标本检测（抗体效价确定）
将国家参考品最低检测限参考品 S（原液）浓度为 2×108U/mL，稀释成3.78×105U/mL。
加样前，样本与金标记抗N蛋白抗体按100μL：0.2μL比例混合，混合后按100μL的加样量将样品滴加在NC膜一端，对上述标本检测，示意图如下：


每个厂家原料重复40次，记录T线结果，进行列联表χ2检验，结果如下：
                                            2.5×105U/mL结果列联表χ2检验

实际	A公司	B公司	C公司	总数
阴性	12	10	10	32
阳性	28	30	30	88
总数	40	40	40	120
χ2=	0.3409	χ2（0.05,2）=	5.9915

χ2<χ2（0.05,2）,差异不显著
筛选的三组配对抗体的检测国家参考品稀释的低浓度3.78×105U/mL标本，经χ2检验，结果差异不显著。由于B公司和C公司的低浓度阳性率最高，优先考虑B、C公司。进一步通过其他试验筛选原料。
3.1.5.6抗体最低浓度确定方法
将B、C公司金标记抗体按不同浓度的标记后与不同浓度的T线抗体组合，按工艺制备成试纸条，如下图：

抗体	T线抗体浓度1（0.8mg/mL）	T线抗体浓度2（1.0mg/mL）	T线抗体浓度3（1.2mg/Lm）
金标记抗体浓度1（1.0mg/mL）	试纸条1	试纸条2	试纸条3
金标记抗体浓度2（2.0mg/mL）	试纸条4	试纸条5	试纸条6
金标记抗体浓度3（4.0mg/mL）	试纸条7	试纸条8	试纸条9

用不同的试纸条对企业参考品中的阴阳性标本进行检测结果如下：

B公司
抗体	T线抗体浓度1（0.8mg/mL）	T线抗体浓度2（1.0mg/mL）	T线抗体浓度3（1.2mg/Lm）
金标记抗体浓度1（1.0mg/mL）	阳性：5/10阴性：10/10	阳性：8/10阴性：10/10	阳性：10/10阴性：10/10
金标记抗体浓度2（2.0mg/mL）	阳性：8/10阴性：10/10	阳性：10/10阴性：10/10	阳性：10/10阴性：9/10
金标记抗体浓度3（4.0mg/mL）	阳性：10/10阴性：10/10	阳性：10/10阴性：9/10	阳性：10/10阴性：8/10
C公司
抗体	T线抗体浓度1（0.8mg/mL）	T线抗体浓度2（1.0mg/mL）	T线抗体浓度3（1.2mg/Lm）
金标记抗体浓度1（1.0mg/mL）	阳性：5/10阴性：10/10	阳性：8/10阴性：10/10	阳性：9/10阴性：10/10
金标记抗体浓度2（2.0mg/mL）	阳性：8/10阴性：10/10	阳性：9/10阴性：10/10	阳性：9/10阴性：9/10
金标记抗体浓度3（4.0mg/mL）	阳性：9/10阴性：10/10	阳性：10/10阴性：9/10	阳性：10/10阴性：8/10

有结果可知，B公司产品阴阳性符合率最高，其T线抗体浓度为1.0mg/mL、金标记抗体浓度为2.0mg/mL时，通过调试，能满足使用要求。
3.1.5.7交叉反应
依据新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂注册审查指导原则（2022年第18号）对交叉反应样本的要求进行试验。




由上述试验结果可知，上述交叉反应物质对3个厂家的抗体对均不存在明显的交叉反应。68例交叉反标本（阴性标本）的符合率为100%，进一步通过其他试验筛选原料。
3.1.5.8内源/外源物质干扰
依据新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂注册审查指导原则（2022年第18号）对内源/外源物质干扰样本的要求进行试验。
在病毒抗原临界阳性水平（4.2×105U/mL）进行干扰试验验证。每种干扰物质的潜在最浓度条件及试验结果如下：


由上述试验结果可知，上述内源/外源物质干扰物质对3个厂家的抗体对均不存在明显的干扰效应。
3.1.5.9不同毒株检测结果（功能性试验）
选取不同毒株作为样本，加样前，样本与金标记抗N蛋白抗体按100μL：0.2μL比例混合，混合后按100μL的加样量将样品滴加在NC膜一端，对上述标本检测，示意图如下：


不同毒株检测结果如下：


附：试验所用新冠病毒毒株信息及滴度


由上述试验结果可知，B公司和A公司的抗体对不同毒株的检测能力最高，无漏检现象。
结合3.1.5.1~3.1.5.8的试验结果，以及性价比因素考虑，最终选择B公司的抗体作为本试剂盒的原料供应商。
3.1.5.10供应商出具的抗体性能指标及检验报告：略
3.2兔IgG和C线羊抗兔抗体

3.2.1制备过程概述：
3.2.1.1兔IgG
（1）血清白蛋白的分离与纯化
①硫酸铵盐析法制备粗白蛋白液：取2.0m1兔血清于管中，逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.0mL室温静置10min，3000r/min离心10min。移液枪小心吸出上层清液作为纯化白蛋白之用。
②凝胶柱层析获得除盐白蛋白液：SephadexG-25层析柱以002mo1醋酸铵缓冲液（pH6。5）平衡，以流速1mL/min洗脱粗制白蛋白液获得除盐的白蛋白液。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm/h、100mV，同时记录吸光度值。
③DEAE-纤维素离子交换层析柱分离白蛋白：装好的DEAE-纤维素离子交换层析柱以0.02mol/L醋酸铵缓冲液（pH6.5）平衡，将去盐收集得的白蛋白液加到纤维素柱上，接上恒流泵，用0.06~0.5mol/L醋酸铵缓冲液（pH6.5）以流速为1mL/min进行梯度洗脱。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm/h、100mV，同时记录吸光度值。
（2）血清γ球蛋白（IgG）的分离与纯化
①硫酸铵盐析获得粗制γ球蛋白液：取2.0mL兔血清于管中，逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.0ml。室温静置10min，3000r/min离心10min，用移液枪小心吸出上层清液作为纯化白蛋白之用，沉淀用0.5mL的0.0175mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.3）溶解作为纯化γ球蛋白之用。
②凝胶柱层析获得除盐粗制γ球蛋白液：SephadexG-25层析柱经0.02mol/磷酸盐缓冲液（pH6.5）平衡后，0.0175mol/磷酸盐缓冲液（pH6.3）以流速lmL/min洗脱粗制γ球蛋白液。核酸蛋白检测仪在0.005A档、走纸速度6cm/h、100mV，同时记录吸光度值。
③DEAE-纤维素离子交换层析柱分离γ球蛋白：将装好的DEAE-纤维素离子交换层析柱先经0.0175mol/磷酸盐缓冲液（pH6.3）平衡后，在纤维素床面上以流速为lml/min的0.0175molL磷酸盐缓冲液（pH6.3）进行洗脱。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm/h、100mV，同时记录吸光度值。④亲和层析法纯化γ球蛋白：用恒流泵，以结合缓冲液平衡柱。流速为0.5mL/min。将DEAE-纤维素离子交换层析后的γ球蛋白溶液上柱，用结合缓冲液洗柱。用5倍床体积的缓冲液洗脱（流速0.5mL/min），收集蛋白液，透析除盐，冻干。
（3）供应商名称：厂家1、厂家2。
3.2.2C线羊抗兔IgG抗体：
（1）羊抗兔IgG抗体抗体制备
取羊毛脂和石蜡油按1：2混合后，经54.88kPa高压灭菌，然后按60g/L加入纯化的兔血清IgG，并按10g/L加入卡介苗，于2支5ml.无菌注射器内进行对抽，使之成为油包水的粘稠乳剂。制成含60g/L兔血清IgG抗原的佐剂-抗原混合物。于山羊两后腿内侧肌肉各注射加佐剂的兔血清IgG抗原2mL（60g/L），每侧分2点注射，背部皮下分4点注射1mL加佐剂的抗原，进行第1次免疫。2周后，进行第2次免疫，方法同第1次。再2周后，于山羊两后腿内侧肌肉各注射2.5mL不加佐剂的兔血清IgG抗原（60g/L），进行第3次免疫。1周后，于山羊颈总静脉注射经加热凝聚的不加佐剂的兔血清IgG抗原5mL（50g/L），进行第4次免疫。再1周后，于山羊颈总静脉加强免疫注射经加热凝聚的不加佐剂的兔血清IgG抗原2mL（50g/L），进行第5次免疫。1周后，抽血。
（2）免IgG-Sephadex G75免疫吸附剂制备
取充分膨胀的Sephadex G75湿胶60ml，放入烧杯中，加入新配制的0.05mol/L过碘酸钠120ml，轻搅拌30min，静置片刻，吸出上清液60ml.加入2mol/L乙二醇50ml，继续搅拌30min。将凝胶移至G2漏斗中抽干，用0.1mol/L Na2CO3（pH9.5）500ml抽洗3次。将凝胶转入烧杯中，加入600mg免IgG（0.1mol/L Na2CO3 60ml配制），4℃轻搅拌20h，尽可能吸出上清液，加入硼氢化钠120mg（0.01mol/L、pH7.2 PB 60ml配制），继续反应60min。将凝胶在G2漏斗中抽干，用500ml、0.01mol/L、pH7.2 PB抽滤3次，加入3mol/L硫氰酸钠120ml（0.01mol/L、pH6.0 PB配制），轻搅拌30min，抽干后再重复反应1次。用600ml、0.01mol/L pH7.2 PB抽滤3次。加入0.1mol/L赖氨酸120ml，在4℃反应18h。抽干凝胶，用0.01mol/L、pH7.4 PBS 200ml抽滤4次，放4℃备用，
（3）二抗（羊抗兔IgG抗体）亲合纯化
在上述免疫吸附剂（G2漏斗内）中加入0.1mol/HCl-甘氨酸缓冲液（pH2.4）100ml，轻搅拌20min，抽干，用生理盐水100ml抽滤2次，用0.01mol/、pH7.4PBS抽滤至凝胶pH平衡到7.4。将漏斗出口封闭，加入经饱和硫酸铵粗提1次的二抗液100ml（相当于二抗血清50ml，事先经0.0lmol/L、pH7.4 PBS平衡透析），轻搅拌反应2h。除去漏斗封口，抽干凝胶，加入生理盐水100～200ml反复抽滤4～5次，再用0.01mol/L PBS 100ml反复抽洗，直至滤出液经紫外检测OD值小于0.02止。加入0.1mol/LHCl-甘氮酸缓冲液（pH2.4）100ml，轻搅拌20min，抽干凝胶，再加人生理盐水100ml，搅匀后抽干，加入0.01mol/L PBS（pH7.4）50ml，同样抽干，收集3次滤液，合并后用1.0mol/L Na2CO3，（pH9.0）调整pH到7～8.装入透析袋，用PEG20000脱水浓缩，再用生理盐水透析24h，除去甘氮酸等杂质，用紫外检测蛋白浓度，放入-40℃低温保存。
（4）供应商名称：厂家1公司、厂家2公司。
3.2.3供应商选择研究资料：
3.2.3.1浓度测量
兔IgG：采用BCA法测定蛋白质浓度，每个样本重复10次，与供应商标示的浓度应无显著差异。结果如下（单位：mg/mL）：

测量次数	厂家1（10.62mg/mL）	厂家2（9.15mg/mL）
n1	10.70	9.14
n2	10.69	9.25
n3	10.50	9.20
n4	10.62	9.17
n5	10.59	9.17
n6	10.59	9.11
n7	10.61	9.09
n8	10.60	9.18
n9	10.58	9.20
n10	10.64	9.26
标示值=	10.62	9.15
平均值=	10.612	9.177
t=	0.443	1.564
t临界=	2.262	2.262

备注：δ未知时，用t检验。
不同厂家蛋白浓度测量结果与标示值不存在显著差异。
羊抗兔IgG抗体：采用BCA法测定蛋白质浓度，每个样本重复10次，与供应商标示的浓度应无显著差异。结果如下（单位：mg/mL）：

测量次数	厂家1（22mg/mL）	厂家2（25mg/mL）
n1	22.07	24.92
n2	21.99	25.12
n3	21.96	25.06
n4	22.06	25.01
n5	22.17	25.00
n6	22.20	24.96
n7	21.99	24.81
n8	22.01	25.05
n9	21.97	24.94
n10	21.99	24.92
标示值=	22.00	25.00
平均值=	22.041	24.979
t=	1.544	0.751
t临界=	2.262	2.262

备注：δ未知时，用单样本t检验。
不同厂家蛋白浓度测量结果与标示值不存在显著差异，可做为原辅材料质量评价标准。
3.2.3.2性能评价
各厂家原料按生产工艺研究资料确定的方法按不同浓度标记金标记兔IgG，C线羊抗兔IgG按不同浓度配制包被液于NC膜上，划线后干燥，制备过程所需其他材料保持一致。


评价标本为40份健康体检标本，编号N1-N40，经PCR确认为SARS-CoV-2 阴性标本。加样前，样本与金标记抗N蛋白抗体按100μL：0.2μL比例混合，混合后按100μL的加样量将样品滴加在NC膜一端，对上述标本检测，示意图如下：


结果判定：质控线划线处应有明显的显色。示例如下：


各配对检测结果如下：


瑕疵：指C线显色不连续、形状不规则等不良。
筛选的两组兔IgG和羊抗兔IgG，40份阴性对照结果质控线划线处均有明显的显色，但厂家2部分显色结果存在瑕疵，最终选择厂家1作为羊抗兔IgG抗体、兔IgG原料供应商，从检测结果看，羊抗兔IgG抗体浓度为1mg/mL、兔IgG浓度为2mg/mL。
3.2.4供应商出具的抗体性能指标及检验报告：略
3.3NC膜

3.3.1制备过程简述
①将硝酸纤维素高分子材料溶解在有机溶剂中，并加入水溶性甘油做为成品滤膜的润湿添加剂，以及有机稀释剂。
②将上述溶液平铺在连续转动的滚轮或输送带上，将空调空气与溶液接触，然后将在滚轮上或输送带上的初生滤膜，放入5℃-50℃水浴池中，进行终成型，然后将成型后的滤膜从滚轮或输送带上剥离。
③后处理时，将滤膜进行不等连或等连拉伸，再经清洗液清洗，然后在 25℃ -80℃温度下进行干燥，得其终产品。
3.3.2供应商名称：MDI、**公司。
3.3.3供应商选择研究资料：
3.3.3.1毛细管流时(sec/4cm)
将不同厂家的NC膜裁剪成40mm×3mm大小若干，在NC膜一端滴加纯化水，记录纯化水通过毛细现象扩散到另一端的时间，对结果进行分析。


结果如下（单位：秒）：

测量次数	MDI（140±28）	**公司（110±20）
n1	138.65	107.21
n2	136.63	113.23
n3	131.76	115.62
n4	137.30	109.46
n5	151.45	112.75
n6	145.38	112.72
n7	143.10	108.48
n8	139.67	108.26
n9	148.09	106.52
n10	144.36	108.06
标示值=	140.00	110.00
平均值=	141.639	110.231
μ=	0.370	0.073
μ临界=	1.645	1.645

备注：δ已知时，用μ检验。
检测结果与各厂家给定质量标准一致，可用于原辅材料质量评价标准，MDI毛细管流时更长，能让抗原抗体在层析过程中充分反应，进一步用其它试验筛选原材料。
3.3.3.2厚度均一性
将两厂家的NC膜裁剪成150mm×3mm大小若干，每隔10mm用游标卡尺测量NC膜厚度，共10条，每个厂家100个数据。
厚度测试结果如下（单位：mm）：


μ检验结果显示μ<μ临界，不同厂家NC膜厚度与标示值一致，可用于评定产品质量标准。
对两组数据进行方差齐性检验，统计量F=s12/s22=1.295<F临界=1.392。
进一步对两样本进行df=n1+n2-2的双样本等方差t检验，t=0.394 <t临界=1.972。两厂家膜厚度差异不显著。进一步用功能性试验确定是否适用于本产品。
3.3.3.3功能性测试
各厂家原料按生产工艺研究资料确定的方法标记兔IgG、鼠抗SARS-CoV-2单克隆抗体N蛋白抗体（识别氨基酸序列：104-LSPRWYFYYLGTGPEAGL-121），C线、T线抗体按1mg/mL配制包被液于NC膜上划线后干燥，制备过程所需其他材料保持一致。
评价标本为3.78×105U/mL标本，以及40份健康体检标本，编号N1-N40，经PCR确认为SARS-CoV-2 阴性。加样前，样本与金标记抗N蛋白抗体按100μL：0.2μL比例混合，混合后按100μL的加样量将样品滴加在NC膜一端，对上述标本检测，示意图如下：







列联表结果

筛选的不同厂家的NC膜检测国家参考品稀释的低浓度3.78×105U/mL标本，经χ2检验，结果差异不显著，40份阴性对照结果均为阴性，且质控线均显明显红色，但MDI检出率更高，最终确定MDI作为本试剂盒NC膜供应商。
3.3.3.4供应商出具的NC膜性能指标及检验报告：略
3.4氯金酸

3.4.1制备过程简述
在双氧水和盐酸溶液中，溶金反应如下∶


3.4.2供应商名称：A公司、B公司。
3.4.3供应商选择研究资料：
3.4.4按如下方法用不同种来源的氯金酸制备胶体金溶液，制备时，除氯金酸来源不同外，其他试剂均来源一致：
(1) 量取100 ml纯化水倒入三角烧瓶中，加入搅拌子后在磁力搅拌器上加热至约80-90℃；
(2) 加入1％氯金酸溶液1ml，继续加热搅拌至沸腾；
(3) 迅速加入1％柠檬酸三钠水溶液0.6ml；
(4) 加速搅拌继续煮沸约5min，直至溶液由透明变成黑色，再逐渐变成紫红色透明，冷却后用纯化水将胶体金溶液定容至100ml待用。
用纳米粒度仪测量胶体金颗粒的均直径，重复取样测量10次，三种胶体金颗粒的直径测量结果如下：

测量次数	A公司	B公司
n1	70.14	70.82
n2	71.32	71.63
n3	70.24	71.90
n4	71.96	70.87
n5	70.56	71.01
n6	71.76	71.90
n7	71.71	70.42
n8	70.35	71.49
n9	71.13	71.23
n10	71.07	70.79
标准差	0.67	0.51
平均值	0.671	0.507
CV	0.95%	0.71%

对两组数据进行方差齐性检验，统计量F=s12/s22=1.751<F临界=2.978。
进一步对两样本进行df=n1+n2-2的双样本等方差t检验，t=0.684 <t临界=2.101。两厂家氯金酸制备胶体金颗粒直径差异不显著，但B公司胶体金颗粒直径的CV值更小（即粒径的均一性更好），更适合作为氯金酸原料供应商。
3.4.5供应商出具的原料性能指标及检验报告：略
3.5玻璃纤维

3.5.1供应商名称：A公司、B公司。
3.5.2供应商选择研究资料：
3.5.2.1释放速度比较
将玻璃纤维按0.3μL/mm分别喷涂金标记羊抗兔IgG和金标记鼠抗SARS-CoV-2并干燥后，与NC膜及吸水纸组装后，在玻璃纤维上滴加100μL样本稀释液，观察玻璃纤维停止释放金标记物的时间（NC膜与玻璃纤维接触处不再有红色胶体金颗粒，如下图“观察位置”），记录时间，重复测试10次，比较测试结果。


停止释放金标记物的时间比较结果（单位：秒）：

测量次数	A公司	B公司
n1	307	292
n2	301	314
n3	312	280
n4	308	305
n5	305	307
n6	319	291
n7	303	312
n8	317	284
n9	282	311
n10	307	289
标准差	10.236	12.625
CV	3.3%	4.2%

对两组数据进行方差齐性检验，统计量F=s12/s22=1.521<F临界=2.978。
进一步对两样本进行df=n1+n2-2的双样本等方差t检验，t=1.479 <t临界=2.101。两厂家玻璃纤维释放时间差异不显著，但A公司停止释放金标记物时间的CV值更小，更适合作为玻璃纤维原料供应商。
3.5.2.2吸水性比较
裁取10cm×10cm 大小玻璃纤维10片，分别称量干重，然后在纯化水中浸泡10s后沥干，称量湿重，计算每一片干湿重差，并对三个厂家的检测结果进行统计分析。
干湿重测量结果如下（单位：g）：


干湿重差计算结果如下（单位：g）：

测量次数	A公司	B公司
n1	5.71	5.74
n2	5.71	5.63
n3	5.87	5.60
n4	5.72	5.97
n5	5.61	5.95
n6	5.85	5.88
n7	5.72	5.83
n8	5.45	5.62
n9	5.70	5.81
n10	5.73	5.84
标示值=	5.75	5.75
平均值=	5.707	5.787
δ=	0.375	0.375
统计量μ=	0.363	0.312
μ临界=	1.645	1.645

μ检验结果显示μ<μ临界，不同厂家玻璃纤维吸水性与标示值一致，可做为质量标准评定。
对两组数据进行方差齐性检验，统计量F=s12/s22=1.326<F临界=2.978。
进一步对两样本进行df=n1+n2-2的双样本等方差t检验，t=1.417 <t临界=2.101。两厂家玻璃纤维吸水性差异不显著，进一步通过其它试验筛选。
3.5.2.3克重比较
裁取10cm×10cm 大小玻璃纤维10片，分别称量干重，并对两厂家的检测结果进行统计分析。
重量测量结果如下（单位：g）：

测量次数	A公司	B公司
n1	0.748	0.661
n2	0.760	0.667
n3	0.773	0.654
n4	0.764	0.658
n5	0.739	0.656
n6	0.773	0.664
n7	0.750	0.665
n8	0.735	0.656
n9	0.783	0.656
n10	0.754	0.658
标示值=	0.75	0.66
平均值=	0.758	0.660
标准差	0.117	0.135
CV	2.05%	2.33%
δ=	0.025	0.005
统计量μ=	0.999	0.316
μ临界=	1.645	1.645

μ检验结果显示μ<μ临界，不同厂家玻璃纤维克重与标示值一致，但A公司的CV值更小，优选其作为玻璃纤维原料供应商。
3.5.2.4毛细管流时(sec/4cm)
将两个厂家的玻璃纤维裁剪成40mm×3mm大小若干，在玻璃纤维一端滴加纯化水，记录纯化水通过毛细现象扩散到另一端的时间，对结果进行分析。


结果如下（单位：秒）：

测量次数	B公司	A公司
n1	40	37
n2	45	39
n3	33	48
n4	37	44
n5	39	39
n6	35	38
n7	34	39
n8	40	43
n9	44	39
n10	49	36
标示值=	40	40
平均值=	39.600	40.200
标准差	5.168	3.676
CV	13.05%	9.14%
测量标准差	5.17	3.68
δ=	5.000	5.000
μ=	0.253	0.126
μ临界=	1.645	1.645

μ检验结果显示μ<μ临界，不同厂家玻璃纤维毛细管流时与标示值一致，可用于评定产品质量标准。
对两组数据进行方差齐性检验，统计量F=s12/s22=1.977<F临界=2.978。
进一步对两样本进行df=n1+n2-2的双样本等方差t检验，t=0.299 <t临界=2.101。两厂家玻璃纤维毛细管流时差异不显著，但A公司毛细管流时的CV更小，更利于产品质量控制，优选其作为玻璃纤维原料供应商。
3.5.2.5金标记物残留
待3.5.2.1测试完成后，在玻璃纤维上再次滴加100μL样本稀释液，在“观察位置”观察是否继续有金标记物释放，观察结果

测量次数	A公司	B公司
n1	无	无
n2	无	无
n3	无	无
n4	无	无
n5	无	无
n6	无	无
n7	无	无
n8	无	无
n9	无	无
n10	无	无

观察结果显示，不同厂家玻璃纤维第一次滴加100μL样本稀释液后，均无残留，释放充分，无明显差异。
综上，最终选择A公司作为玻璃纤维合格供应商。
3.5.3供应商出具的原料性能指标及检验报告：略
3.6样品垫

3.6.1供应商名称：A公司、B公司、C公司。
3.6.2吸水性比较
裁取10cm×10cm 大小样品垫10片，分别称量干重，然后在纯化水中浸泡10s后沥干，称量湿重，计算每一片干湿重差，并对三个厂家的检测结果进行统计分析。


对上述三组数据进行Bartlett方差齐性检验，结果如下：


方差分析结果P=0.62383>0.05，三组数据平均数差异不显著，三个供应商吸水纸质量不存在显著差异。取总平均值-1.96*标准差作为质量控制标准，即吸水性不低于4.65g/100cm2。最终选择测量结果CV值最小的A公司作为样品垫原料供应商。
3.7吸水纸
3.7.1供应商名称：A公司、B公司、C公司。
3.7.2吸水性比较
裁取10cm×10cm 大小吸水纸10片，分别称量干重，然后在纯化水中浸泡10s后沥干，称量湿重，计算每一片干湿重差，并对三个厂家的检测结果进行统计分析。
干湿重测量结果如下（单位：g）：


μ检验结果显示μ<μ临界，不同厂家玻璃纤维吸水量与标示值一致，可做为产品质量评定标准。
对两组数据进行方差齐性检验，统计量F=s12/s22=1.856<F临界=2.978。
进一步对两样本进行df=n1+n2-2的双样本等方差t检验，t=0.402 <t临界=2.101。两厂家吸水性差异不显著。
3.7.3毛细管流时(sec/4cm)
将不同厂家的吸水纸裁剪成40mm×3mm大小若干，在吸水纸一端滴加纯化水，记录纯化水通过毛细现象扩散到另一端的时间，对结果进行分析。


结果如下（单位：秒）：

测量次数	**公司	**公司
n1	112	162
n2	143	145
n3	142	119
n4	166	149
n5	170	146
n6	130	163
n7	143	123
n8	156	152
n9	155	149
n10	152	132

对两组数据进行方差齐性检验，统计量F=s12/s22=1.306<F临界=2.978。
进一步对两样本进行df=n1+n2-2的双样本等方差t检验，t=0.684 <t临界=2.101。两厂家吸水纸毛细管流时差异不显著，最终选择测量结果CV值最小的**公司作为吸水纸原料供应商。
3.7.4供应商出具的原料性能指标及检验报告：略
四、 原材料来源的确定

各原材料供应商确定如下：

序号	原材料	厂家
1	C线用羊抗兔IgG	**公司
2	T线用鼠抗SARS-CoV-2单克隆抗体N蛋白抗体（识别氨基酸序列：99-GKMKDLSPRWYFYYL-113）	**公司
3	金标记用鼠抗SARS-CoV-2单克隆抗体N蛋白抗体（识别氨基酸序列：104-LSPRWYFYYLGTGPEAGL-121）	**公司
4	金标记用兔IgG	**公司
5	NC膜	**公司
6	氯金酸	**公司
7	玻璃纤维	**公司
8	吸水纸	**公司

五、 原材料质量标准的确定

经前期研究，原材料质量标准明确如下：

序号	原材料	厂家	质量标准
1	C线用羊抗兔IgG	****有限责任公司	1、蛋白浓度：在标示值±10%范围内2、纯度：应不小于95%（SDS-PAGE法）
2	T线用鼠抗SARS-CoV-2单克隆抗体N蛋白抗体（识别氨基酸序列：99-GKMKDLSPRWYFYYL-113）	****科技有限公司	1、分子量：重链分子量在50ku左右，轻链分子量在25ku左右2、效价：不低于1：20003、蛋白浓度：在标示值±10%范围内
3	金标记用鼠抗SARS-CoV-2单克隆抗体N蛋白抗体（识别氨基酸序列：104-LSPRWYFYYLGTGPEAGL-121）	****科技有限公司	1、分子量：重链分子量在50ku左右，轻链分子量在25ku左右2、效价：不低于1：20003、蛋白浓度：在标示值±10%范围内
4	金标记用兔IgG	****有限责任公司	1、蛋白浓度：在标示值±10%范围内2、纯度：应不小于95%（SDS-PAGE法）
5	NC膜	****有限责任公司	1、厚度：205±20μm2、层析时间（s/40mm）：>90
6	氯金酸	****有限公司	按工艺制备胶体金颗粒，直径应在70nm±7nm范围内
7	玻璃纤维	****有限公司	1、克重：<80g/m22、吸水量：>500g/m2
8	吸水纸	****有限公司	1、克重：<370g/m22、吸水量：>350g/m2

五、 企业参考品制备

5.1样本来源
依据新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂注册审查指导原则（2022年第18号）要求制备，制备企业参考品的样品来源信息如下：

序号	毒株编号	备注	来源
1	GDIPH.028	2019-nCoV阳性	广东省公共卫生研究院（Pangolineage/VOC）：BA.2.3/ Omicron
2	GDIPH.002	2019-nCoV阳性	广东省公共卫生研究院（Pangolineage/VOC）：A
3	GDIPH.018	2019-nCoV阳性	广东省公共卫生研究院（Pangolineage/VOC）：B1.617.2/Delta
4	GDIPH.006	2019-nCoV阳性	广东省公共卫生研究院（Pangolineage/VOC）：B
5	GDIPH.019	2019-nCoV阳性	广东省公共卫生研究院（Pangolineage/VOC）：B1.617.2/Delta
6	/	HKU1抗原阳性	病毒培养液稀释
7	/	OC43抗原阳性	病毒培养液稀释
8	/	NL63抗原阳性	病毒培养液稀释
9	/	229E抗原阳性	病毒培养液稀释
10	/	流感病毒抗原阳性	病毒培养液稀释
11	/	肠道病毒抗原阳性	病毒培养液稀释
12	/	呼吸道合胞病毒抗原阳性	病毒培养液稀释
13	/	腺病毒抗原阳性	病毒培养液稀释
14	/	健康体检1	中大五院
15	/	健康体检2	中大五院
16	/	健康体检3	中大五院

5.2样本确认方法：
5.2.1新型冠状病毒阳性样本的确认
符合《依据关于印发新型冠状病毒肺炎防控方案(第八版)》的通知中相关要求的试剂盒：中山大学达安基因股份有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法），注册证编号：国械注准20203400749。
广州万孚生物技术股份有限公司的新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（胶体金法），注册证号：国械注准20203400830。
采用上述试剂盒检测后，采用高通量测序技术对样品进行全基因组测序，将获得的序列跟GenBank上公开的全基因组序列进行比对。
5.2.2新型冠状病毒阴性样本的确认
符合《依据关于印发新型冠状病毒肺炎防控方案(第八版)》的通知中相关要求的试剂盒：中山大学达安基因股份有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法），注册证编号：国械注准20203400749。
广州万孚生物技术股份有限公司的新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（胶体金法）注册证号：国械注准20203400830。
5.2.3HKU1抗原、OC43抗原、NL63抗原、229E抗原标本的确认
采用高通量测序技术对样品进行全基因组测序，将获得的序列跟GenBank上公开的全基因组序列进行比对；
5.2.4其他标本的确认
流感病毒抗原标本：采用中山大学达安基因股份有限公司甲型流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）试剂盒，注册证编号国械注准20173404562，以及广州万孚生物技术股份有限公司甲型流感病毒抗原检测试剂(胶体金法)，注册证号：国械注准20173401243；
肠道病毒抗原标本：采用中山大学达安基因股份有限公司肠道病毒通用型核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），注册证号：国械注准20173400169；
呼吸道合胞病毒抗原标本：采用中山大学达安基因股份有限公司呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），注册证号国械注准20173400171，以及杭州创新生物检控技术有限公司呼吸道合胞病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）注册证号国械注准20173404326；
腺病毒抗原标本：圣湘生物科技股份有限公司腺病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)注册证号国械注准20223400291，以及广州万孚生物技术股份有限公司腺病毒抗原检测试剂（免疫层析法）注册证号国械注准20173401317。
5.3滴度确定方法（TCID50确定方法）：
按照Reed-Muench法计算 TCID50，具体过程如下：
选择培养36h生长旺盛、成层较好的Vero 细胞一瓶，弃去生长液，加入0.05% EDTA-胰酶5mL，37℃消化5~10min，倾去消化液，加入含10%FBS的DMEM重悬细胞，使细胞悬液浓度为5×105/mL，将稀释好的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.2mL，37℃、5%CO2培养箱中培养18~24h，待细胞长成单层后，弃去培养液，PBS 洗2次。将待测病毒培养物用含2%FBS的DMEM 作10倍递度稀释（如下表），每孔加入不同浓度病毒稀释液0.1mL，每个稀释度8个复孔，另设8 个对照孔，37℃孵育1.5h，然后每孔加入细胞维持液0.1mL，逐日观察细胞CPE（细胞病变效应），连续观察4d。
病毒稀释方法

稀释倍数	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
SARS-Cov-2(mL)	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
维持液（mL）	0.9	0.9	0.9	0.9	0.9	0.9	0.9

TCID50计算方法（Reed-Muench法，接种剂量为每孔0.1mL），示例：


距离比例=（高于50%的死亡分数-50%）/(高于50%的死亡分数-低于50%的死亡分数)
        =（83%-50%）/（83%-17%)
        =0.5
TCID50的对数=高于50%病毒稀释的对数+距离比例×稀释系数的对数
本例高于50%病毒稀释的对数为-3，距离比例为0.5，稀释系数的对数为-1。代入上式：
LgTCID50=-3+0.5×（-1）= -3.5，即TCID50=10-3.5/0.1mL。
确认结果如下：


5.4企业参考品制备
标本来源：前文确认的标本。
阴性基质：前文健康体检3样本加入到样本提取液中制备而成。
企业参考品中P1、P3、P5、P7、P9为新型冠状病毒不同来源的原倍阳性样本加入到样本提取液中制备而成，P2、P4、P6、P8、P10为对应的P1、P3、P5、P7、P9原倍样本用阴性基质稀释后制得，阴性参考品考虑检测特异性的评价，应包括冠状病毒（HKU1\OC43\NL63\229E）、流感病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等抗原阳性样本（N1~N8），精密度参考品C1、C2为P1原倍样本用阴性基质稀释后制得，C3为阴性样本，精密度参考品中的低值C2滴度为500TCID50/mL，不高于3LoD（200×3=600TCID50/mL）。检出限参考品L1、L2、L3为P3原倍样本用阴性基质稀释后制得。
制备的企业参考品信息如下：

序号	编号	基因型或病毒类型	滴度/浓度/Ct值	备注
1	P1	BA.2.3/ Omicron	6.3x105TCID50/mL	滴度1（原倍样本）
2	P2	BA.2.3/ Omicron	4000CID50/mL	滴度2（P1用阴性样本稀释后制得）
3	P3	A	3.2x105TCID50/mL	滴度1（原倍样本）
4	P4	A	1000TCID50/mL	滴度2（P3用阴性样本稀释后制得）
5	P5	B1.617.2/Delta	5.0x105TCID50/mL	滴度1（原倍样本）
6	P6	B1.617.2/Delta	700TCID50/mL	滴度2（P5用阴性样本稀释后制得）
7	P7	B	6.3x106TCID50/mL	滴度1（原倍样本）
8	P8	B	5000TCID50/mL	滴度2（P7用阴性样本稀释后制得）
9	P9	B1.617.2/Delta	2.0x106TCID50/mL	滴度1（原倍样本）
10	P10	B1.617.2/Delta	4000TCID50/mL	滴度2（P9用阴性样本稀释后制得）
11	N1	HKU1抗原阳性	1×105PFU/mL	病毒培养液稀释
12	N2	OC43抗原阳性	1×105PFU/mL	病毒培养液稀释
13	N3	NL63抗原阳性	1×105PFU/mL	病毒培养液稀释
14	N4	229E抗原阳性	1×105PFU/mL	病毒培养液稀释
15	N5	流感病毒抗原阳性	1×105PFU/mL	病毒培养液稀释
16	N6	肠道病毒抗原阳性	1×105PFU/mL	病毒培养液稀释
17	N7	呼吸道合胞病毒抗原阳性	1×105PFU/mL	病毒培养液稀释
18	N8	腺病毒抗原阳性	1×105PFU/mL	病毒培养液稀释
19	N9	/	0TCID50/mL	中大五院健康体检1
20	N10	/	0TCID50/mL	中大五院健康体检2
21	C1	BA.2.3/ Omicron	2×103TCID50/mL，Ct值：17.23	高值来源1稀释，
22	C2	BA.2.3/ Omicron	500TCID50/mL，Ct值：19.65	低值，来源1，（检出限附近的浓度，2.5LoD）
23	C3	/	0TCID50/mL	中大五院健康体检3
24	L1	A	218TCID50/mL	C50+20%
25	L2	A	200TCID50/mL	C50+10%
26	L3	A	182TCID50/mL	C50

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