细胞免疫荧光-IF

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免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
免疫荧光的基本原理是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
步骤：

（1）细胞准备：取出生长状态良好的细胞，弃培养基，消化重悬细胞；细胞接种于6孔板中，每孔3×105细胞，37℃ 5% CO2空气的细胞培养箱中培养24 h；
（2）细胞培养好后，根据自己的实验对细胞进行处理；
（3）处理完成后，弃去培养基，在细胞上缓慢加入PBS，清洗7次，每次5 s；尽量把杂质去除干净；
（4）细胞固定：在细胞上覆盖1 mL 4%多聚甲醛固定液，置于4℃，固定15 min；或者室温固定20 min；
（5）去除固定液，使用4℃预冷的TBS（或PBS）清洗3次，每次5 min；
通透（可选）：加入TBS缓冲液配置的0.3%Triton X-100室温孵育10min，TBS漂洗3次，每次5min（膜蛋白忽略）。
（6）封闭：用5% BSA将样本覆盖，将孔板封闭好，置于37℃培养箱孵育30 min；
（7）一抗孵育：去除封闭液，直接在细胞上滴加一抗工作液，将孔板封闭好，置于4℃孵育过夜；
（8）复温：将细胞置于常温，复温15 min，去除抗体工作液，用TBS（或PBS）洗涤3次，每次5 min；
（9）二抗孵育：在细胞上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，室温避光孵育1 h；
（10）去除二抗工作液，用TBS（或PBS）洗涤3次，每次5 min；
（11）染核：在细胞上滴加500 µL DAPI工作液，避光室温孵育10 min；去除DAPI工作液，用TBS（或PBS）洗涤3次，每次5 min；
（12）直接加入抗荧光衰减封片剂，于荧光显微镜下观察并采集图像；并利用Image J定量分析。
如果使用细胞爬片，则需提前将爬片放入6孔板中，再接种细胞。

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