探秘科研前沿：抗体 - 寡核苷酸偶联物技术深度剖析

治疗性寡核苷酸能调节多种蛋白质表达，在疾病治疗方面极具潜力。像mRNA可诱导目标蛋白表达，反义寡核苷酸（ASO）和小干 RNA（siRNA）能实现蛋白表达的下调。不过，这些寡核苷酸亲水性强、带负电，膜通透性差，常规的脂质纳米颗粒封装、阳离子纳米颗粒递送，以及与Tri-GalNAc结合的靶向技术，都局限于肝脏靶向，难以拓展到其他器官，大大限制了它们的临床应用。

为突破这一困境，将寡核苷酸与单克隆抗体结合的AOCs技术应运而生，它能把治疗性寡核苷酸精准送到特定组织，目前已进入临床试验阶段。本文就详细介绍了一种从现成抗体出发，制备、纯化和分析AOCs的实验方案。

整个实验流程主要分为四大关键步骤，每个步骤都经过精心设计，以确保最终能得到高质量的抗体 - 寡核苷酸偶联物。

这一步是为后续的偶联反应做准备。先将含有胺基的单链或双链寡核苷酸与连接子结合，生成BCN - 连接子 - 寡核苷酸偶联物。具体操作时，要在特定的反应缓冲液中进行，严格控制反应条件，比如温度、时间等，同时避免使用含胺缓冲液。反应结束后，经过沉淀、干燥等处理，再对产物进行浓度测定和纯度检测。

利用赖氨酸偶联的方式，给抗体接上叠氮基团，制成抗体 - 叠氮偶联物。反应过程中要使用无水DMSO，防止胺反应性基团水解，且部分连接子的半衰期短，需现配现用。反应结束后，通过凝胶过滤自旋柱纯化，再对产物进行浓度测定和质谱分析前的处理。

此步骤针对制备抗体 - siRNA偶联物，若制备抗体 -ASO偶联物则可跳过。把修饰后的寡核苷酸与互补链混合，在特定温度下孵育，让它们形成双链结构。这里的温度控制十分关键，冷却过程也要缓慢进行，以保证双链结构的稳定性。

通过应变促进的炔 - 叠氮环加成反应（SPAAC），将带有连接子的双链寡核苷酸与抗体 - 叠氮偶联物结合，生成抗体 - 寡核苷酸偶联物。反应完成后，用尺寸排阻色谱（SEC）纯化，去除多余的siRNA。接着，进行浓缩、过滤、浓度测定等操作，最后通过质谱和HPLC分析偶联物的结合程度和分子身份。

在整个实验过程中，有许多需要特别注意的地方，这些细节直接关系到实验的成败。比如，涉及寡核苷酸的操作，尤其是RNA，必须在经RNAseZap清洁的生物安全柜中进行，防止核酸酶降解；反应缓冲液、沉淀缓冲液以及各种分析方法所用的缓冲液，都有严格的配方和保存期限；不同的偶联反应，对连接子的选择、用量，以及反应条件都有特定要求，需严格按照方案执行。

按照这个实验方案操作，预期能取得不错的成果。在寡核苷酸 - BCN偶联物合成方面，通过RP - HPLC检测，期望实现完全转化，产率达到55% - 85%，平均产率为70%。抗体 - 叠氮偶联物的平均结合度约为2.5 - 3.0，产率高于90%，且无聚集现象。抗体- siRNA偶联物的平均结合度在1.0 - 1.5之间，经SEC纯化后的产率为40% - 60%，并且不存在未结合的抗体。

任何技术都不是完美的，该实验方案也存在一些局限性。例如，寡核苷酸偶联时溶液的pH值至关重要，pH > 8.5时RNA易降解，过高的pH还会使活化物种水解加快；连接子结构不同，反应时间过长可能影响寡核苷酸偶联物的质量；抗体- siRNA偶联物在沉默实验中的效果，还与所用抗体和靶抗原有关，且较低的结合度虽有好处，但也会影响偶联物的生物物理性质。

针对这些问题，文章也给出了相应的解决办法。比如，严格控制反应混合物的pH值在7.4 - 8.0；确保寡核苷酸浓度足够，使用低温保存的丙酮促进沉淀；在生物安全柜中规范操作，减少核酸酶对寡核苷酸的降解等。

这篇研究为科研工作者提供了一套详细、可操作的抗体 - 寡核苷酸偶联物制备、纯化和分析方案。相信随着技术的不断完善和优化，AOCs在精准医疗领域将发挥更大的作用，为更多患者带来新的希望。对于从事生物医药研究的小伙伴们来说，这无疑是一份极具价值的科研指南，大家可以深入研读，将其应用到实际研究中。

参考文献：

Rady T, Lehot V, Most J, Erb S, Cianferani S, Chaubet G, Basse N, Wagner A. Protocol to generate, purify, and analyze antibody-oligonucleotide conjugates from off-the-shelf antibodies. STAR Protoc. 2024 Dec 20;5(4):103329. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103329. Epub 2024 Sep 28. PMID: 39342618; PMCID: PMC11470600.