实验对照设计（一）SPC设置是数据可靠性的"雾镜"

yunchu1991

一、实验对照——科学研究的"对照组"

在科研和检测实验中，对照组是区分真实信号与实验噪声的"黄金标准"。无论是PCR中的阴性对照、Western Blot的内参对照，还是细胞实验的空白对照，每一种对照都像一把钥匙，解开数据可信度的密码。

对于大多数实验来说，对照主要包括以下几种类型：

1.1阴性对照（negative control，NC）：其作用是能确认实验系统无污染或非特异性反应。比如内毒素检测中使用无热原水 + 鲎试剂（应无凝胶形成），PCR实验中以水代替DNA模板（应无扩增条带生成）。这些都是阴性对照的示例。

1.2阳性对照（positive control，PC）：其作用是验证实验体系能正常检测目标物质。比如WB使用已知表达目标蛋白的样本，若出现阳性条带则说明实验体系正常工作。

1.3样品阳性对照（Spiked Recovery Control，SPC）：也常被叫做加标回收对照组。其作用是检测样品基质是否干扰实验反应（如抑制或增强信号）。比如内毒素检测中使用待测样品+已知内毒素是否形成凝胶来判断样品是否有干扰。在生化检测中，使用血清样本+标准品的加标回收率实验来判断样品中是否有明确干扰。

1.4空白对照（blank control）：其作用是排除试剂或背景干扰。比如分光光度法测吸光度时，用溶剂来进行调零。细胞实验中用空培组来调零CCK8实验的结果等。

1.5内参对照（internal control）：其作用是校正样本量或仪器波动等实验操作误差。比如QPCR实验中GAPDH内参；WB实验中的β-actin等。

1.6实验对照组（Experimental control）：其作用是验证特定处理的效果。比如药物实验中的不加药的溶剂对照组等。

然而，在众多对照类型中，样品阳性对照（Spiked Recovery Control, SPC） 却常被忽视。它的缺失可能导至假阴性、假阳性，甚至整批实验数据作废。

二、SPC是实验数据的"雾镜"2.1 SPC的定义与核心作用

样品阳性对照（SPC） 是在待测样品中加入已知浓度的目标物（如内毒素、标准品），用于验证样品基质是否干扰检测系统。

它的本质是回答一个问题：
"如果样品中有目标物，实验方法能准确检测出来吗？"

2.2 SPC与其他对照的对比

对照类型	作用	与SPC的区别
NC阴性对照	排除污染/背景信号	不涉及样品基质干扰
PC阳性对照	证明方法有效	使用纯标准品，未模拟真实样品
SPC	验证样品本身不干扰检测	直接针对样品基质

二、如果不设置SPC呢?

如果不设置SPC的话，可能会导至假阴性或者假阳性结果，尤其在方法开发环节如果SPC没有被纳入到检测指标内，其后果不堪设想。

案例1：抗生素注射剂的"假阴性"事件

某药企在注射用头孢曲松钠的内毒素检测中，未设置SPC，直接检测结果为阴性。但后续临床使用中，多名患者出现发热反应。

复盘发现：头孢曲松钠中的 β-内酰胺环结构 抑制了鲎试剂的凝固反应，导至内毒素漏检。

若设置SPC：在样品中添加内毒素后未凝胶，可提前发现干扰，通过稀释或换用重组因子C（rFC）法解决。

案例2：细胞培养液的"假阳性"乌龙

某实验室检测细胞培养上清的内毒素时，结果异常偏高。排查后发现：

培养液中的 β-葡聚糖（来自酵母提取物）激活了鲎试剂的G因子途径，误判为内毒素污染。

若设置SPC：使用特异性鲎试剂（仅响应LPS）可避免误判。

教训：SPC是发现基质干扰的"警报器"，跳过它等于蒙眼走钢丝。

SPC如此重要，具体哪些类型的检测需要设置SPC呢?

三、哪些实验必须设置SPC？3.1内毒素检测（鲎试验）

强制要求：药典（ChP/USP/EP）明确规定，所有药品、医疗器械需SPC验证。

典型场景：注射剂（尤其含螯合剂、高蛋白的品种）及生物制品（疫苗、抗体、重组蛋白）。

3.2复杂基质样本分析

样本类型	潜在干扰因素	SPC解决方案
血液/血清	抗凝剂（肝素、EDTA）	稀释样本或添加中和剂
细胞培养液	β-葡聚糖、胎牛血清蛋白	使用特异性鲎试剂
中药提取物	多糖、酚类化合物	加热灭活或过滤处理

3.3方法开发与验证

新检测方法建立时，必须用SPC验证抗干扰能力。前段时间实验室开发支原体检测方法，检测方法的样本类型发生了变化。之前是先提取样本的DNA，再检测，而新方法直接用细胞培养基进行快检。实验室的小姑娘跑来问我：

“老师我们的对照怎么设?”

“你的意见呢?”

“NC、PC？”

“NC和PC具体是什么呢？”我问

“NC是水，PC是支原体标准品”

“如果细胞培养基有抑制物或者增强物，怎么通过这两组对照得出可靠结论呢? ”我再问

“那怎么设呢？”

“NTC 、NCS、PC、SPC这4组，水是NTC，完全培养基为NCS，支原体标准品为PC，完全培养基+最低检出限的标准品作为SPC ”

“可是之前的方法只用了NC和PC ”小姑娘追问

“检测样品更换，则需要第一时间反应到样品基质中是否携带干扰物，需要思考如何设置合理对照，得到可靠的结果”

在科研和质控中，对照组是数据的"镜子"，而SPC则是这面镜子上的"防雾涂层"。它可能增加10%的实验成本，却能避免100%的误判风险。因此在考虑对照设置时，一定不能忘。