立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索

图文播报

查看: 114|回复: 0

[分享] 实验教程|浙大学姐手把手教你做CRISPR/Cas9

[复制链接]
发表于 2025-7-5 06:32 | 显示全部楼层 |阅读模式

登陆有奖并可浏览互动!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有账号?立即注册 微信登录 手机动态码快速登录

×
大家好我最近看到一篇文章来分享给大家1

RNA如何整合到载体DNA中? CRISPR/Cas9的基因编辑是如何实现的?如何确定目标序列的剪切起始位点?在此过程中,需要设置对照实验。我们使用的是ABCLON的GOLDEN GATE混合液,可一步完成酶切和连接反应。那么,CRISPR/Cas9与载体构建有何区别?
今天我们将探讨CRISPR/Cas9的相关知识。CRISPR/Cas9源自细菌的免疫系统。在自然界中,细菌会遭受病毒(即噬菌体)的攻击。当噬菌体入侵时,细菌会截取一段病毒DNA插入自身基因组的CRISPR区域,称为spacer。当相同病毒再次入侵时,细菌就能识别这段spacer对应的病毒DNA,并利用CRISPR系统中的Cas9蛋白切割病毒DNA,实现免疫防御。
在细菌中,Cas9是位于CRISPR位点附近、负责编码DNA切割蛋白的基因。科学家将CRISPR与Cas9结合,构建到载体中,开发出能够定点修饰DNA序列的分子生物学工具。无论是基因敲除、报告基因插入,还是点突变,CRISPR/Cas9都能胜任。
实验中,我们使用由Cas9蛋白和sgRNA组成的”分子剪刀”。sgRNA(Single Guide RNA)是一种合成RNA,包含两个部分:crRNA负责引导Cas9识别目标DNA序列,tracrRNA则协助crRNA与Cas9结合。现代实验中通常使用融合的单链sgRNA替代。
可能有同学会问:最终需要构建的是DNA载体,RNA如何整合到DNA载体中?实际上,我们设计的是编码sgRNA的DNA序列(sgDNA),将其插入表达载体,使其在细胞内转录生成sgRNA。
sgRNA如何引导Cas9定位目标DNA?其crRNA部分通过人工设计,与目标DNA序列完全互补;tracrRNA部分则具有固定结构,用于稳定sgRNA与Cas9的结合。正是crRNA与目标序列的碱基配对,确保了CRISPR/Cas9的精确定位。
接下来,我们将探讨CRISPR/Cas9在体外实验中的应用原理。
首先,构建含有sgRNACas9的载体序列,并将其导入细胞中进行表达。sgRNA会引导Cas9定位到目标DNA序列,随后Cas9在目标位点进行切割。当细胞修复DNA时,可能出现错误,即非同源末端连接,或通过人为编辑实现同源重组,从而完成DNA编辑。这一过程与之前提到的载体构建步骤相似。
CRISPR/Cas9技术的核心在于载体酶切与连接部分。实验中使用了AppColon的Golden Gate 2X Assembly Max预混液,可一步完成酶切和连接反应,实现多达8个插入片段的特定顺序组装。相较于传统方法需要4-5小时,现在仅需半小时即可完成所有步骤。经测试,试剂反复冻融20次或在37℃存放7天后性能保持稳定。
接下来详细解析CRISPR/Cas9在体外实验中的作用机制。首先,已表达的sgRNA会与Cas9蛋白结合形成复合体。该复合体在基因组中扫描时,Cas9并非随机结合DNA,而是需要识别PAM序列。PAM是Cas9识别并启动剪接的信号序列,通常为NGG(N代表任意碱基)。若无PAM序列,Cas9既不会停留也不会剪切。这一特性源于CRISPR/Cas9系统的进化起源:作为细菌的防御系统,Cas9通过识别病毒DNA特有的PAM序列来区分外源DNA与宿主DNA。
当定位到目标DNA后,Cas9会使DNA局部解旋。sgRNA的前20个碱基将与DNA单链进行配对验证。完全匹配后,Cas9会在PAM序列上游约3个碱基处产生双链断裂(DSB),实现基因编辑。
接下来我们将进行DNA改造。请注意,在整个载体构建过程中,我只提到了用于识别目标基因序列的sgRNA,而并未像常规载体构建那样指定插入的具体目标序列。那么CRISPR/Cas9系统是如何实现基因改造的呢?
首先需要明确,Cas9蛋白本身并不改变DNA序列,它仅起到”分子剪刀”的作用。DNA切割后,基因编辑的完成依赖于细胞自身的修复机制。当Cas9完成切割后,会产生双链断裂(DSB)。细胞修复双链断裂主要有两种途径:

  • 非同源末端连接(NHEJ):这是细胞的默认修复方式。该机制直接将断裂的DNA末端连接起来,不依赖任何模板。这一过程常会导致几个碱基的插入或缺失,造成阅读框移位或蛋白质失活,从而实现基因沉默的效果。
  • 同源重组修复(HDR):当提供包含报告基因或特定突变的修复模板时,细胞可利用该模板进行精确修复。这种方法适用于需要插入报告基因或引入特定点突变的情况。
本期内容以基因敲除(沉默)为主。虽然同源重组在载体构建中也经常使用,但由于其涉及的内容较为复杂,在此不做详细展开。如有需要,后续可专门讲解同源重组相关内容。
CRISPR/Cas9系统与传统载体构建的主要区别在于:传统方法(如基因过表达或敲低)通常不改变DNA序列本身,而是调控其表达;而CRISPR/Cas9直接对DNA进行切割和修改,效果更为精准彻底。
实验所需材料包括: - 含有Cas9的载体 - 表达sgRNA的序列 - 细胞系或生物模型(如293T细胞、小鼠胚胎干细胞等) - 若需插入报告基因,还需准备修复模板
关于CRISPR/Cas9载体,市面上有多种类型可供选择,具体信息请参考相关资料。
我这里使用的是lentiCRISPRv2载体,它属于慢病毒感染系统,一次感染即可完成基因编辑。配套的sgRNA为BR3-B1,我使用的是Abclone公司提供的BR3-B1预混液。
首先,我们需要了解实验的整体框架和具体操作步骤。


这里需要说明的是,接下来介绍的所有实验步骤均适用于基因沉默,即基因敲除。


若需报告基因相关内容,我们将另行制作视频讲解。
首先,设计并合成sgRNA序列。此前已提及,sgRNA的tracrRNA部分固定不变,仅需设计其crRNA部分。在此过程中,可选用在线sgRNA设计工具完成操作。常用工具已列出,可根据个人偏好进行选择。
关于目标序列的剪切位点选择,建议选取起始密码子后第一个或第二个外显子区域,优先选择保守外显子,以确保对所有剪切体均有效,同时需避开功能未知的可变剪切区域。
sgRNA序列的筛选标准可参考以下要点。


确定好sgRNA序列,还记得我们之前提到的内容吗?


我们克隆的是与sgRNA序列对应的sgDNA序列,因此实际合成的是sgDNA。直接将设计工具生成的序列送至合成公司即可,无需额外添加酶切位点和tracrRNA部分。
本实验采用的LentiCRISPR v2载体已包含tracrRNA序列,故无需另行合成。使用时需确认所用载体是否包含tracrRNA序列。我们只需在合成的sgDNA序列上添加酶切位点,最终送公司合成的DNA序列即告完成。
第二步是构建CRISPR载体,以LentiCRISPR v2为例。首先酶切CRISPR载体并与sgDNA序列连接。可能有同学会问:为何省略PCR步骤?这是因为sgDNA序列已由公司直接合成,无需扩增。此前进行PCR是因插入载体的目标序列过长,需先合成引物再扩增。如有疑问可回顾相关视频内容。
关于酶切验证,本实验无需设置对照组。因仅使用一种酶,酶切后即可直接连接。我们采用Agilent的GelGreen预混液,可实现酶切与连接同步进行,故无需验证酶切效率,只需最终筛选测序正确的质粒。
推荐载体与sgDNA用量及反应体系如下:按比例配制后,42℃水浴反应10分钟即可。相比传统方法耗时两日,此方案仅需半小时即可完成。Agilent新推出的GelGreen预混液确实高效便捷。
第三步包括转化筛选、测序、质粒提取、慢病毒包装及感染等步骤,具体操作可参考相关视频教程。
第四步是筛选CRISPR阳性细胞。常用方法为抗性筛选:LentiCRISPR v2载体携带两种抗性基因,分别为氨苄青霉素抗性和氨甲蝶呤抗性。
那么我们具体采用哪种方法呢?氨苄青霉素筛选用于筛选带有正确质粒的大肠杆菌,而抗性筛选则用于筛选阳性细胞。
第二种方法是单克隆筛选,即将CRISPR/Cas9感染后的细胞群分离成单个细胞克隆,再逐一进行测序检测,以确认是否完成了基因编辑。这显然是一项工作量巨大的任务。
若仅需获得稳定敲除的细胞群,则无需进行单克隆筛选,仅需进行抗性筛选即可。所谓稳定敲除的细胞群,是指通过qPCR、Western blot等分子检测手段对比阳性与阴性细胞群时,可观察到阳性细胞群表现出明显的敲除效果。但这并不意味着阳性细胞群中的每个细胞都经过了CRISPR/Cas9编辑,仅表明其整体表现出了编辑效果。
若需要获得纯合敲除的细胞系,则必须进行单克隆筛选,例如用于长期稳定实验时,需确保编辑的一致性。此外,敲入实验或点突变实验通常也需要进行单克隆筛选。
抗性筛选操作较为简单,可参考文字版实验方案。我们将重点讨论单克隆筛选的两种方法:有限稀释法流式细胞分选法


稀释法操作步骤如下:
首先,对感染后的细胞群进行抗性筛选,随后将细胞消化为单细胞悬液,并使用细胞计数仪进行计数。根据细胞密度,计算稀释目标浓度,即每孔平均0.5-1个细胞
对于90孔板体系,每孔加入100微升细胞悬液即可。因此,细胞悬液需稀释至500-1000个细胞/毫升。根据稀释公式计算稀释倍数,使用完全培养基稀释细胞并充分混匀。
此外,建议设置不同稀释梯度(如0.5个细胞/孔、1个细胞/孔、2个细胞/孔),以确保获得单细胞克隆


取出96孔板,每孔加入100微升稀释后的细胞悬液。


轻轻晃动96孔板使细胞分布均匀,放入37摄氏度培养箱中孵育。
第1至3天,每天用显微镜检查并标记含有单克隆细胞的孔,可在盖板上标记或用Excel表格记录。舍弃含多细胞或无细胞的孔,每2至3天更换一次培养液,维持10至14天。
当克隆生长至70%至90%融合时,可转至24孔板扩大培养,再扩增至6孔板等。
获得足够细胞后,先冻存一批,请务必养成及时冻存细胞的好习惯


欢迎各位,若在实验过程中遇到问题,可以追溯问题所在。
接下来进行测序验证,以确认单克隆细胞是否为所需的阳性细胞
第一步,设计引物,扩增目标区域,覆盖切割位点上下游约200至400个碱基对。引物设计的具体内容请参考相关笔记,关键点已在此处标注。
第二步,使用细胞基因组DNA提取试剂盒提取DNA。不同试剂盒的操作方法各异,此处不再演示。最终DNA浓度应达到50至200纳克每微升,OD260/280比值约为1.8。
第三步,进行PCR扩增。详细步骤已在笔记中说明,未了解的实验人员可查阅相关内容。
第四步,将样本送至测序公司进行测序。如何评估测序结果?可查看公司提供的测序图谱,或使用分析工具进行判断。
若在此阶段顺利获得纯合的阳性细胞,则实验成功。


因为单克隆筛选通常是一个耗时较长的过程。
除了单克隆筛选,还有流式分选。由于流式分选之前已详细讲解过,此处不再演示。
具体的CRISPR/Cas9实验流程已为大家整理在此。


如果尚未了解刘氏相关内容,可以参考以下笔记。
CRISPR/Cas9技术涉及的内容非常广泛且复杂。在此,我将重点介绍实验室中常用的部分内容。如需了解更多详细信息,欢迎留言咨询。


原文地址:https://zhuanlan.zhihu.com/p/1923433610997928290
回复

使用道具 举报

发表回复

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册 微信登录 手机动态码快速登录

本版积分规则

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

快速回复 返回列表 客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
快速回复返回顶部 返回列表