铁死亡检测方法指南：关键标志物分析与染色方法指南 | MCE

mce · 发表于 2025-6-30 14:22

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检测铁死亡的方法包括：检测代谢反应（如脂代谢、铁代谢和 GSH 相关代谢）相关标志物含量变化、细胞形态变化、和分子蛋白含量/活性变化。

01

脂代谢相关生物标志物检测

过度的脂质过氧化通过产生有毒的磷脂氢过氧化物（PLOOH），在促进铁死亡中起着重要作用。因此，脂质过氧化相关的生物标志物是铁死亡的关键检测指标。

1.1 脂质过氧化物检测

BODIPY 581/591 C11 是一种脂溶性比率型荧光探针，能够嵌入细胞膜并与细胞内的脂质相互作用。在未氧化状态下，呈现红色荧光 (还原型；Ex=581 nm, Em=591 nm)。

当细胞发生铁死亡时，亚铁离子 (Fe2+) 和 ROS 促进脂质氧化，形成脂质过氧化物，BODIPY 581/591 C11 被氧化，发射波长从 591 nm 转移到 510 nm，产生绿色荧光 (氧化型；Ex=500 nm, Em=510 nm)。

需要注意的是，BODIPY 581/591 C11 对脂溶性膜内各种活性氧 (ROS) 和过氧亚硝酸盐 (ONOO-) 也较为敏感，因此它也可以用于铁死亡细胞中 ROS 和 RNS 的检测。

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BODIPY 581/591 C11 染色参考

1. 储备液及工作液的制备:

(1) 用 DMSO 配制 10 mM BODIPY 581/591 C11 储备液（-20°C 或 -80°C 避光保存，避免反复冻融）。

(2) 染色前用无血清细胞培养基或 PBS 稀释储备液，制备 2-10 μM BODIPY 581/591 C11 工作液

（请根据实际情况调整工作液浓度）。

2. 细胞染色：

(1) 细胞制备

悬浮细胞：4°C, 1000 ×g 离心 3-5 分钟，弃上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分钟。

贴壁细胞：弃去培养基，加入胰蛋白酶解离细胞，制成单细胞悬液。4°C, 1000 ×g 离心 3-5 分钟，弃上清。

PBS 洗 2 次，每次 5 分钟。

(2) 加入 1 mL BODIPY 581/591 C11 工作液，室温孵育 30 分钟。

(3) 4°C, 400 ×g 离心 3-4 分钟，弃上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分钟。

(4) 用 1 mL 无血清细胞培养基或 PBS 重悬细胞，荧光显微镜或流式细胞仪检测。

1.2 活性氧的检测[20]

活性氧（ROS）在铁死亡过程中不仅促进脂质过氧化和细胞损伤，还抑制抗氧化信号通路，是铁死亡检测的重要生物标志物。H2DCFDA（DCFH-DA）是一种可渗透细胞的活性氧探针。进入细胞后，H2DCFDA 在细胞内脱酯化，并被 ROS 氧化成具有强烈荧光的 DCF，产生绿色荧光（Ex: 488 nm, Em: 525 nm）。通过荧光显微镜、流式细胞仪或分光光度计等设备可以检测细胞内 ROS 水平。

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H2DCFDA 染色方法参考

1. 储备液及工作液的制备 :

(1) 用DMSO配制5mM的H2DCFDA储备液（-20°C或 -80°C避光保存，避免反复冻融）。

(2) 染色前用无血清细胞培养基或PBS稀释储备液，配制成1-10μM的H2DCFDA工作液。

（请根据实际情况调整工作液浓度）。

2. 细胞染色：

(1) 悬浮细胞

· 离心收集细胞，保持密度约为1×106

个。PBS洗涤两次，每次5分钟。

· 加入1mL 染料工作液，室温孵育5-30分钟。

· 400×g离心3-4分钟，弃上清。PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。

· 用1mL无血清培养基或PBS重悬细胞，使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察。

(2) 贴壁细胞

· 将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。

· 从培养基中移出盖玻片，置于载玻片上，吸除多余培养基。加入 100 μL 染料工作液，

轻轻晃动使其完全覆盖细胞，孵育 5-30 分钟。

· 吸去染料工作液，培养基洗 2-3 次，每次 5 分钟，使用荧光显微镜观察。

注：若需要用流式细胞仪检测，需将细胞用胰蛋白酶消化并重悬后再进行染色。

1.3 过氧化脂质衍生物的检测[21][22]

脂质过氧化反应过程中，大量的脂质过氧化初级产物在氧化反应中逐渐分解为一系列复杂的醛类化合物，包括 MDA，4-HNE，丙醛和己醛等。这些活性醛类物质能够攻击蛋白质等生物大分子，形成加合物，从而引发细胞的进一步损伤。

Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit 是一种基于硫代巴比妥酸 (TBA) 反应物法的试剂盒，脂质过氧化产物 MDA 与 TBA 在高温和酸性条件下反应，形成一种具有特定颜色的 MDA-TBA 复合物，其最大吸收波长通常在 532 nm 处，可通过比色法来定量检测脂质过氧化水平。

此外，4-HNE 抗体可以用来定量检测 4-HNE 水平。需要注意的是，MDA 和 4-HNE 在除铁死亡外的多种氧化应激状态下均可产生，在实际应用中，一般与其他检测方法进行相互验证，以提高结果的可靠性和准确性[10]。

02

铁代谢相关生物标志物检测[23]

在铁死亡过程中，细胞内 Fe2+的积累会导至氧化应激的增加，从而促进脂质过氧化。因此，细胞铁含量或者 Fe2+/Fe3+ 比值的测定可作为铁死亡监测的重要指标。FerroOrange 是一种特异性 Fe2+ 探针，可与 Fe2+ 结合形成橙红色荧光复合物。通过荧光显微镜或流式细胞术检测（Ex/Em: 542/572 nm），可以实现定量分析细胞内 Fe2+ 的浓度。

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03谷胱甘肽代谢相关生物标志物检测

谷胱甘肽（GSH）是细胞内主要的抗氧化。在铁死亡过程中，GSH 水平显著下降，可导至细胞抗氧化能力减弱，进而促进脂质过氧化物的积累。因此，检测 GSH 相关代谢等指标可用于监测铁死亡的过程。

3.1 GSH 含量检测[24]

比色法，荧光探针法，ELISA，HPLC 和质谱等方法都可以用来检测 GSH 含量。例如，GSH/GSSG Assay Kit是一种基于二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）法的 GSH 含量检测试剂盒，DTNB 能够与还原型 GSH 发生特异性反应形成一种黄色的化合物⸺硫代二硝基苯酮（TNB），同时释放出氧化型 GSH（GSSG）。生成的 TNB 在 405 nm 波长下具有强吸收，可以通过比色法测定。

此外，Monochlorobimane 等 GSH 荧光探针也可用来检测 GSH 含量变化。

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3.2 胱氨酸摄取活性检测[26]

System xc-以 1:1 的比例用胞内谷氨酸来换取胞外胱氨酸（Cys2）的输入，随后被还原为为半胱氨酸（Cys）。抑制System xc-的活性会抑制胱氨酸的吸收，影响 GSH 的合成，导至 GPX4 活性降低，促进铁死亡。因此，胱氨酸摄取活性可作为表征 System xc- 活性的检测指标，可通过 Cys 探针检测胞内 Cys 含量。

04细胞和亚细胞水平的形态学检测

4.1 细胞形态

铁死亡细胞的典型形态学特征包括质膜完整性丧失、细胞膜破裂、线粒体萎缩、线粒体外膜破裂、嵴减少或缺失和膜密度增加（Figure 9），可通过透射电子显微镜（TEM）检测。TEM 的主要缺点是：样本制备过程繁琐，需要进行脱水、包埋和切片等步骤，可能导至细胞形态的改变，从而影响观察结果。

电镜分析方法参考[27]

1. 样品固定：用 2% 戊二醛（0.1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.4）固定细胞。

2. 脱水并包埋：2% OsO4 固定细胞切片后，用乙醇脱水，包埋在 Epok 812 中。

3. 切片染色：使用超微切片机切割后，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，以增强对比度。

4. 观察记录：将染色后的切片放入 TEM 中，观察并记录线粒体的形态变化。

4.2 亚细胞器变化

铁死亡发生时，伴随着线粒体膜通透性增加和线粒体膜电位降低，内质网粘度增加和内质网应激，以及溶酶体铁或一氧化氮（NO）的累积。可借助相关荧光探针，用流式细胞仪或荧光显微镜检测[28]。

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05调控铁死亡的基因和蛋白的检测

铁死亡主要由铁依赖性脂质过氧化引起，其调控机制包括多种，主要分为：过氧化代谢部分（如铁代谢和脂代谢途径）和抗氧化部分（如 System xc--GSH-GPX4 途径，AIFM2-CoQ10/GCH1-BH4/ESCRT-III 和 DHODH 途径）。铁死亡发生时，一些关键基因和蛋白表达水平会发生变化，因此，可采用 Western blot/免疫荧光/免疫组织化学/实时荧光定量 PCR 等技术来表征铁死亡的发生。

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