三代测序哪家强？PacBio vs Nanopore 深度解析

心中u你

还在被二代测序的短读长和扩增误差困扰？
三代测序强势破局——
✅ 无需PCR扩增，数据真真实
✅ 长读长，助力精准研究
✅ 直接检测修饰，赋能表观遗传研究
作为三代测序两大顶流，PacBio和Nanopore究竟谁更胜一筹？

一、PacBio测序

01.技术发展

2011年，Pacific Biosciences推出PacBio RS测序仪，实现长读长测序，但误差率较高。之后陆续推出Sequel System、Sequel II System、Sequel IIe System，数据输出逐步提升。2022年推出的Revio系统，测序通量大幅提高，工作流程简化，准确性提升。

02.技术原理

基于SMRT（Single Molecule, Real-Time）技术，利用SMRT细胞（含数百万个纳米级孔，即零模波导ZMWs）进行高保真DNA测序。DNA聚合酶在ZMWs中复制环形化DNA片段，添加荧光标记核苷酸时会发出荧光，用于碱基识别。通过多次复制同一DNA片段，生成一致序列（CCS），提高测序准确性。


PacBio测序方法：不同的仪器采用相同的化学原理，基于一种名为SMRT（单分子实时）细胞的硅芯片。该芯片拥有数百万个用于测序反应的小孔（A）。在每个小孔中，固定有单个DNA分子，注入荧光标记的核苷酸后，该DNA分子即可进行复制（B）。荧光信号被记录下来并用于碱基识别（C）。

03.文库制备

DNA文库制备包括DNA片段化（片段大小通常15 - 20kb，可根据应用调整）和连接发夹适配器形成SMRTbell模板，确保每条DNA片段的正义链和反义链都能被测序，提高CCS生成准确性。RNA文库制备采用Iso - Seq方法，无需cDNA片段化和转录本组装，可分析全长转录本，还可与MAS - Seq串联方法结合提高转录本异构体测序通量。


PacBio 文库制备流程：以基因组 DNA 为起始材料，文库制备过程的第一步是 DNA 片段化。然后，将 DNA 片段进行发夹式连接，以获得适合聚合酶结合和测序的 SMRTbell 文库（A）。全长 mRNA 也可用作输入样本。实际上，先将 mRNA 进行逆转录、扩增，再进行发夹式连接。得到的 SMRTbell 文库即可用于测序（B）。

04.优势与局限

优势

• 平均读长15 - 20kp；
  
• 测序准确性高（可达99.9%）；
  
• 可分析复杂基因组区域；
  
• 能直接检测甲基化；
  
• 罕见突变检测/高复杂区域解析/小样本精准测序研究场景中更具优势。
  

局限

• 与其他三代测序相比，读长较短，平台成本较高，生信分析能力要求更高。
  

二、ONT牛津纳米孔测序

01.技术发展

2014年推出，基于纳米孔的单分子测序技术，在多个研究领域取得成功。先后推出MinION、PromethION、GridION X5等设备，通量不断提升。

02.技术原理

不同于PacBio的SMRT技术，其只是跳出了链末端终止法的框架，纳米孔测序几乎完全摒弃了旧的“话语体系”——它从光的语言（荧光检测），转变成了电的语言（电信号检测）。纳米孔系统由纳米传感器组成，DNA或RNA通过纳米孔时，会引起电流变化，产生独特的“波形”（squiggle），通过碱基识别算法确定序列。纳米孔分为固态纳米孔（应用广泛）和生物纳米孔（由特定细菌产生）。


牛津纳米孔测序方法图：现有多种具有不同通量的仪器，它们均基于纳米传感器的使用，这些纳米传感器能够实时检测DNA分子在电流中引起的变化（A）。实际上，流动池包含数千个纳米孔，每个纳米孔都能够测量通过的电流；因此，当DNA分子通过纳米孔时，它会根据自身序列改变电流（B）。这种典型的“波形”用于后续的碱基识别（C）。

03.文库制备

DNA文库制备有快速和高通量两种策略，快速策略利用转座酶复合物切割DNA并连接适配器，高通量策略包括DNA片段化、末端修复和适配器连接。RNA文库制备支持直接cDNA和RNA测序，无需逆转录，直接将适配器连接到mRNA分子上。


牛津纳米孔技术（ONT）文库制备流程图：DNA文库可通过快速方案获得，该方案利用转座酶同时进行DNA切割和接头连接；也可通过高通量流程制备，即先进行DNA片段化，再进行接头连接（A）。RNA文库可通过cDNA合成和接头连接获得，或者直接将接头连接到RNA分子上（B）。

04.优势与局限

优势

• 超长读长，读长可达10kb - 4Mb，三代测序中佼佼者；
  
• 可直接检测RNA；
  
• 能直接检测甲基化和其他DNA修饰；
  
• 有便携式测序仪，可实时现场监测；
  
• 超大基因组组装/表观遗传图谱/低成本长读长研究场景中更具优势。
  

局限

• 测序成本仍高于二代测序；
  
• 生物信息学分析要求较高。
  

三、总结




PacBio：精准狙击手，适合“小样本+高精度”需求（临床/罕见变异首选）。
Nanopore：全能战士，适合“长读长+实时性+表观”场景（科研/组装场景更优）。

参考文献

Scarano C, Veneruso I, De Simone RR, Di Bonito G, Secondino A, D'Argenio V. The Third-Generation Sequencing Challenge: Novel Insights for the Omic Sciences. Biomolecules. 2024;14(5):568. Published 2024 May 10. doi:10.3390/biom14050568


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