技术速递 | 为什么CRISPR筛选不推荐使用浓缩慢病毒？

奋斗的小鸟

慢病毒因其高效整合和稳定表达的特性，成为递送sgRNA文库的首选载体。然而，在实验设计中，浓缩慢病毒（如通过超速离心或PEG沉淀提高病毒滴度）可能引入多重技术风险。目前市面上大多数文库病毒供应商均提供浓缩慢病毒，主要原因是大部分公司的包装流程都是从传统单基因慢病毒包装体系演化而来的。单基因干预病毒是同一个质粒的包装产物，一个细胞接受多个慢病毒可能影响表达量而不会造成根本方向性差异。但是，CRISPR文库慢病毒是几千甚至上万个不同的质粒包装而成异质混合物病毒，且CRISPR筛选因为只允许一个细胞进一个sgRNA，所以权威研究几乎没有浓缩慢病毒的做法。
本文将详细探讨为何不选用浓缩慢病毒背后的科学原理、实验偏差来源及替代方案，以期为研究者提供全面的技术指导。
一、权威来源做法
我们来看看张锋团队于2017年发表于Nature Protocols上论文，这篇论文类似CRISPR筛选红宝书，本文中未对慢病毒进行浓缩，病毒包装结束后直接过滤后分装保存于-80℃。此外，国外共享平台Addgene也向外提供慢病毒包装服务，对于 LentiCRISPRv2载体骨架而言，慢病毒总滴度为1.3*10^8 TU，慢病毒每毫升滴度为2*10^6/mL，总体积65 mL为未浓缩病毒。



研究者常会问：为什么别人CRISPR筛选结果这么好，我却很难取得好结果？其实取得理想结果并不难，做好以下三点即可：第一，就是需要使用高质量文库（平衡性好即Skew ratio<5、覆盖度佳即Coverage rate>99.9%、正确率高即Mapping率>85%都很重要）；第二，就是不要使用浓缩慢病毒！不要使用浓缩慢病毒！不要使用浓缩慢病毒！重要的事情说三遍！；第三，就是低MOI（小于0.3）和高覆盖乘数（大于500x）去做病毒感染。如果满足以上三个条件，基本都能取得满意结果。


二、慢病毒浓缩对CRISPR文库单克隆性的破坏
1. 单克隆性原则的核心地位
CRISPR筛选的核心假设是：每个细胞仅携带一个sgRNA，且该sgRNA对应的基因编辑直接导致细胞表型变化（如增殖、凋亡、耐药性等）。这一假设成立的前提是实验满足“单克隆性”（Clonality），即MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）严格控制在 MOI ≤ 0.3。此时，病毒感染细胞的概率服从泊松分布，约70%的感染细胞仅携带一个sgRNA。
2. 浓缩病毒导致MOI升高
浓缩慢病毒的本质是提高病毒颗粒浓度（如从1×10⁶ TU/mL浓缩至1×10⁸ TU/mL）。假设细胞数为1×10⁶，我们添加原始病毒量为300 ul（3×10⁵ TU，MOI=0.3），而浓缩后（1×10⁸ TU/mL）只需添加3 ul浓缩病毒即可达到相同MOI，微量吸样误差等操作可能导致MOI偏大。此外，浓缩过程的不可控性（如病毒颗粒聚集、滴度测定误差）常导致实际MOI偏大，此时单个细胞可能被多个病毒颗粒感染。
3. 多sgRNA整合的后果
假阳性/假阴性干扰：若一个细胞同时整合了sgRNA-A（靶向促凋亡基因）和sgRNA-B（靶向无关基因），其存活表型可能被错误归因于sgRNA-B。统计学噪声加剧：高MOI下，不同sgRNA的整合数量差异会破坏文库的均一性。例如，某些细胞可能整合多个相同sgRNA（增强表型），而另一些细胞整合不同sgRNA（表型抵消），导致数据分析时无法区分真实信号与噪声。

三、病毒聚集与感染效率下降
1. 超速离心的物理作用
离心时，病毒颗粒受到强剪切力与高速碰撞，导致：包膜结构变形：VSV-G蛋白构象改变，无法有效结合细胞表面受体（如LDLR）。核酸泄漏：病毒包膜破裂后，部分sgRNA释放至培养基中，被RNase降解。
2. 聚集体的感染障碍
空间位阻：聚集的病毒颗粒（直径>1μm）难以通过细胞膜内陷形成的胞饮小泡（通常<200nm）。受体竞争：聚集体表面的VSV-G蛋白可能相互遮蔽，减少与细胞受体的结合位点。
3. 实验数据支持
对比超速离心与直接感染（未浓缩）的病毒：浓缩后病毒滴度名义上提高100倍，但实际感染效率仅增加20倍。透射电镜显示，浓缩病毒中约30%颗粒形成聚集体（直径>500nm）。聚集体对文库病毒感染过程的单克隆性是致命硬伤。

四、替代方案与优化策略
1. 病毒生产优化
包装细胞选择：HEK293T细胞因其高转染效率与病毒产量，成为主流选择。推荐使用非常适合高滴度慢病毒包装的LentiX293T细胞并使用研美生物生产的CRISPR文库慢病毒包装试剂盒（VK101）可获得高质量文库慢病毒。



图片来源（https://www.takarabiomed.com.cn/）

2. 离心增强感染（Spinoculation）
低速离心法：将病毒与细胞在800-1200×g下离心2小时，通过轻微离心力促进病毒吸附，感染效率可提高3-5倍。优势：避免病毒浓缩，维持MOI≤0.3，同时减少聚集风险。
3. 化学增强剂
Polybrene（终浓度8 μg/mL）：中和病毒与细胞膜的负电荷排斥，提高结合效率。硫酸鱼精蛋白（5 μg/mL）：通过电荷相互作用稳定病毒颗粒，但需注意细胞类型依赖性毒性。
4. 感染条件调整
延长孵育时间：将病毒与细胞共孵育从24小时延长至48小时（需定期补充培养基防止酸化）。分次感染：将病毒分两次加入（间隔12小时），累计提高感染率。

五、总结与操作建议
CRISPR筛选的可靠性依赖于单克隆性、文库均一性、细胞健康与感染效率四大支柱。浓缩慢病毒可能系统性破坏这些条件，导致数据失真。建议研究者优先通过优化生产与感染条件提高效率，仅在严格验证后谨慎使用浓缩病毒。以下是分步操作指南：
1. 病毒生产：使用LentiX293T细胞，优化质粒比例，收集上清后0.45μm过滤。
2. 滴度测定：通过qPCR（检测病毒基因组拷贝数）或荧光报告法（如GFP标记）确定原始滴度。
3. 感染计算：按MOI=0.3计算所需病毒量，不足时优先采用离心增强法。
4. 质量控制：感染后3天提取基因组DNA，PCR扩增sgRNA区域并测序，确认文库覆盖度>90%。
5. 数据分析：使用MAGeCK算法，校正多sgRNA整合与文库偏差的影响。
通过上述策略，研究者可在无需浓缩病毒的前提下，获得高可信度的CRISPR筛选结果。

参考文献
Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols (2017).
Morgens, D.W., et al. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology (2017).




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