免疫组化protocol

心中u你

1）收集组织sample，放在中性jia醛中（4%jia醛）浸泡24h，封蜡14个小时。切片，厚度为3μm。用粘附载玻片向里倾斜45度后将之捞起。静置5min，等水差不多干后再移到架子中。
2）移至65℃烘箱中熔蜡1h。梯度浸泡：二jia苯10min→二jia苯10min→无水乙醇→95%乙醇→85%乙醇→75%乙醇→超纯水→超纯水（各5min）。
3）配好1x抗原修复液后，倒入高压锅中，没过横放的载玻片的高度即可，打开电磁炉使之预热1min后，放入载玻片架子，盖上锅盖后，让它沸腾6min后即可关掉。梯度降温。
4）取出载玻片架子泡入超纯水中，取出配好的3%H2O2盒子，将载玻片架子放入，浸泡10min。
5）用PBS梯度洗液（分别洗2 min、2 min、3min），分别取出载玻片，稍微放在纸巾上，使水珠少一些，（注意不能干片）用免疫标记笔在sample出处划一个小范围，放置在加了一点水的烘盒上。用移液枪滴加5%的BSA封闭，37℃，30min。然后稍微吸弃封闭液后，滴加一抗（用5%BSA稀释，1：100（每个样大概8-10μL）），滴加后稍微压一压滴珠使之受力均匀。孵育1h，37℃，或者4℃过夜。
6）用步骤5）的PBS梯度洗：先把载玻片架子放入PBS-2号盒中，将载玻片取出在PBS-1号盒子中，搅搅后，插入PBS-2号盒的架子中，然后在PBS-2号盒中洗洗后，放入PBS-3号盒
7）分别取出载玻片，稍微放在纸巾上，使玻片干一些，（注意不能干片超过2s），滴加二抗（每个样大概8-10μL），室温孵育30min。
8）用新的PBS梯度洗：分别取出载玻片，稍微放在纸巾上，使玻片干一些，（注意不能干片超过2s），滴加配好的显色剂（每个样大概8-10μL），一般30s-3min后会显棕色。
9）泡在PBS中，拿去复染：泡浸在苏木盒中大约1min，在盒子中用自来水将其清洗几遍即可。
10）脱水至蜡：超纯水→超纯水→75%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→无水乙醇-（各3-5min）→二jia苯10min→二jia苯10min，风干后封片，显微镜拍照。

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