【知识分享】亲和层析介质-分离纯化家庭的新宠

HaHa

一、前言
抗体因其高度特异性及优越的药代动力学特性，长期以来一直被视为最有发展前途的有效的人类疾病治疗药物种类之一。近年来，伴随生物技术快速发展，全球生物医药市场蓬勃发展，抗体药更是成为全球最畅销且增速最快的药物。目前，中国生物医药市场已经是全球医药产业最具前景的市场之一。
众所周知，下游分离纯化工艺是目前控制生物药成本的最重要环节。一方面由于监管部门对生物药的纯度和质量要求越来越高，另一方面用于治疗用的生物分子种类越来越多，结构越来越复杂，并且生物分子对外部条件敏感，稳定性差，杂质多，从而使得生物制药分离纯化的挑战更大。而层析技术对复杂生物分子具有极高的分离纯化效率, 且条件温和, 在分离纯化过程中容易保持目标生物分子的活性，因此层析技术是目前生物药分离纯化最重要的手段。
生物层析方法根据主要分离原理可分为亲和层析、体积排阻（凝胶过滤）层析、离子交换层析，疏水层析等。亲和层析基于生物分子与分离介质之间的特异性相互作用。它的原理是在介质表面接枝特异性的配体，使得配体与生物分子之间形成特异性相互作用，从而分离出特定的生物分子。



图1. 亲和层析原理图

二、亲和层析填料的种类及其应用
在纯化过程，选择合适的亲和填料特别重要，这步骤不仅会影响亲和步骤的成本，还会影响亲和后样品的纯度，收率及下一步纯化工艺步骤的增加或者减少，基于这个原则，接下来我们详细介绍几种常见的亲和层析填料及其应用范围。
1.镍亲和层析介质
过渡金属通过与电子供体配基上能与金属离子相互作用的羧基或氨基的电负性元素（O，N）形成较稳定的金属螯合物。在镍柱亲和层析中，一个Ni2+有六个配位位点，被含有3，4或5个电子供体基团的螯合物固定在吸附剂上，而剩下未被占据的位点暴露于溶液中，能与组氨酸，半胱氨酸和色氨酸的侧链或组氨酸标签的蛋白特异性结合。
金属离子亲和层析中常见的螯合配基有IDA（亚氨基二乙酸）、NTA（次氮基三乙酸）和TED（羧甲基乙二胺）等，分别拥有3、4、5个配位位点与Ni2+结合，而空余的能与组氨酸标签结合的位点还剩3、2、1个。所以IDA与His标签蛋白结合的能力相对最强，特异性较弱，而TED则相反。在实际应用中通常选择载量和特异性适中的NTA类型。



图2. Ni2+分别与配体IDA、NTA、TED的螯合示意图



图3. 天地人和Ni-NTA亲和层析填料

2.GST-tag亲和层析介质
谷胱甘肽-S-转移酶（GST）是生物体内的一类重要的代谢酶，参与外源和内源有毒物质的代谢。GST通过催化还原型的谷胱甘肽（GSH）和有毒物质偶联反应，使有毒化合物的水溶性增加从而更容易排出体外，最终达到解毒的作用。GST亲和层析是利用GST融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价结合，通过GSH竞争洗脱的原理来进行蛋白纯化[8]。GST亲和层析纯化蛋白的条件温和，可以保证蛋白的活性。



图4. 天地人和GST-tag亲和层析填料

3. MBP-tag亲和层析介质
麦芽糖结合蛋白（MBP）有 42.5KD 大小，不含半胱氨酸（Cys），作为融合蛋白的标签，通常放在 N 端在大肠杆菌中进行表达。MBP 能促进融合蛋白的可溶性表达[9]，尤其对于难表达的真核细胞蛋白，膜蛋白病毒蛋白有很好的促溶表达能力，MBP 融合蛋白的纯化在生理条件下进行，使用麦芽糖进行温和洗脱。保护了MBP 标签蛋白的活性。标签在纯化后期需要用酶切去除，常用的内切酶是 Factor Xa，麦芽糖酶和肠激酶。



图5. 天地人和MBP-tag亲和层析填料

4. Protein A亲和层析介质
ProteinA是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG。天然ProteinA有5个IgG结合域和许多其它的未知功能域。重组ProteinA包含5个高IgG结合域，并去除了其它非主要结合域以降低非特异性结合。Protein A亲和层析介质已经广泛用于从生物流体或细胞培液中分离纯化各种类型的IgG或者IgG片段。实验已经证明，Protein A和IgG的相互作用仅涉及Fc区域，而不影响Fab片段和抗原的结合。



图6. 金黄色葡萄球菌Protein A



图7. Protein A与抗体结合示意图

5.肝素亲和层析介质
肝素是一种含有硫酸酯的酸性多糖。根据肝素的生理作用，可以与很多活性调节小分子结合（其生理作用就是和很多活性调节分子结合抑制其作用），故其能和很多血浆蛋白、生长因子、限制内切酶、凝血酶、凝血因子、脂蛋白和干扰素结合。同时肝素的聚阴离子特性，使其还具离子交换的作用，可用于纯化多种核酸结合蛋白。



图8. 肝素亲和层析介质-天地人和Heparin Beads 6FF亲和层析填料

三、未来发展前景
由于亲和层析介质的选择性、可放大性和易于工艺开发的优势，亲和层析技术现在已成为生物药工业化生产的首选技术。
虽然天然蛋白质配基提供的选择性尚未与替代结合剂相匹配，但可以考虑使用其它类型的配基替代。对于无法获得天然配基的纯化任务，发现或开发基于抗体片段或更大多肽结构的配基是该技术未来发展趋势。同时，根据不同场景以及不同蛋白的定制亲和配基和填料技术的出现将推动亲和层析技术在传统非平台化生物药中被采用和实施的次数增加。
亲和层析填料的成本被普遍认为很高，但考虑到填料可以多次使用、提高整体工艺收率以及减少不合格批次的数量，换算为每克药品来计算成本，实际上相当适中。因此，定制亲和层析概念在商业和技术平台上的成熟，将增加定制亲和填料的使用频率，提高生物药生产过程的效率。
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