【免疫组化实验常见问题及解决方法】干货分享，实验人必看！

青草

免疫组化（IHC）是科研与病理诊断中不可或缺的技术，但实验中常因操作细节不当导致结果异常。本文总结了六大常见问题及解决方法，助你轻松避坑，提升实验成功率！
<hr/>一、背景染色过深——“全片着色”怎么办？

• 一抗浓度过高
  新抗体需梯度测试最佳浓度，避免直接按说明书操作。尤其二步法（Polymer）建议缩短一抗孵育时间至30分钟13。
  
• 孵育时间或温度不当
  高温孵育易增加非特异性结合，推荐4℃或室温孵育，并严格计时39。
  
• DAB显色问题
  DAB需现用现配，过滤沉渣，显色时镜下监控，及时终止。避免使用存放过久的DAB溶液17。
  
• 组织干燥
  操作中需保持切片湿润，可用DAKO笔圈画组织边缘防止液体流失18。
  

<hr/>二、脱片——切片“离家出走”如何预防？

• 切片质量与处理
  

• 使用优质多聚赖氨酸玻片，切片厚度控制在3-4μm57。
  
• 烤片温度60℃左右，时间≥2小时，避免组织未充分固定810。
  

<li data-pid="b_Kn1Rfd">操作手法

• 抗原修复时避免剧烈震荡，EDTA修复比柠檬酸更易脱片，建议采用微波修复减少气泡17。
  
• PBS冲洗时“浸泡”代替“冲洗”，轻柔甩片或吸水17。
  

<hr/>三、弱阳性或无信号——目标抗原“隐身”？

• 一抗问题
  

• 浓度过低或孵育时间不足需优化，建议设置阳性对照验证抗体有效性36。
  
• 种属不匹配（如一抗为兔源，二抗需抗兔）会导致信号丢失69。
  

<li data-pid="Oetg9YKk">抗原修复不当
石蜡切片需热修复（微波或高压）或酶消化暴露抗原。不同组织适用方法不同，如核抗原需延长修复时间68。<li data-pid="bPMilFEz">组织处理不当
固定不及时或过度（>24小时）会破坏抗原，建议10%中性福尔马林固定4-24小时58。<hr/>四、非特异性着色——“哪里都有信号”怎么破？

• 内源性干扰
  

• 肝、肾等富含内源性生物素的组织，需提前用亲和素封闭79。
  
• 过氧化物酶丰富的组织用3% H₂O₂阻断，时间10-30分钟79。
  

<li data-pid="yg9WwOuK">封闭不充分
使用5% BSA或同源血清封闭非特异性位点，时间延长至30分钟79。<li data-pid="1m_z0z3f">抗体交叉反应
多克隆抗体易产生交叉，可换用单克隆抗体提高特异性89。<hr/>五、显色异常——DAB显色“失控”如何调控？

• 显色时间过长：镜下监控，浅棕色背景时立即终止710。
  
• 显色过快：可能因抗体浓度过高或封闭不足，需调整一抗浓度或延长封闭时间79。
  
• 显色斑驳：DAB溶液需过滤，避免氧化物沉积，且避光保存610。
  

<hr/>六、注意事项与小贴士

• 抗体保存
  

• 原液-20℃保存，避免反复冻融；工作液4℃短期存放610。
  

<li data-pid="j__5CVlJ">操作细节

• 每步冲洗3×5分钟，缓冲液含0.05% Tween-20可降低背景79。
  
• 苏木素复染后，用淡氨水或温水返蓝5-10分钟78。
  

<li data-pid="Eru8f11a">脱蜡技巧
冬季延长二甲苯脱蜡时间至10-20分钟，预热切片加速脱蜡
原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/1895127583852590012