技术速递 | CRISPR筛选高通量测序分析结果可视化秘籍

John

CRISPR筛选是一种革命性的高通量功能基因组学技术，它将强大的CRISPR-Cas基因编辑工具与大规模并行筛选策略相结合。在实验中，研究者将包含数万至数百万条sgRNA的病毒文库导入细胞群体，使单个细胞通常仅携带一种sgRNA，从而靶向特定基因。随后，细胞群体被置于特定选择压力下（如药物处理、病毒感染、特定生长条件或基于增殖、死亡、荧光标记等表型的分选）。经过筛选，那些sgRNA（及其靶向基因）在特定条件下赋予细胞生存优势或劣势的细胞群会被富集或耗竭。
通过深度测序分析筛选前后细胞群体中sgRNA的丰度变化，研究人员能够大规模、无偏倚地鉴定在特定生物学过程（如细胞存活、药物敏感性/耐药性、病毒感染、信号通路、癌症转移等）中发挥关键作用的基因。高通量测序结果的可视化是CRISPR筛选研究的核心环节，其呈现方式因算法和筛选指标的选择而略有差异。本文将介绍几种常用的CRISPR筛选结果可视化方法。
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01 RRA Score排序图

MAGeCK RRA算法输出的RRA score越小，表明基因在正向（positive）或负向（negative）筛选中富集或耗竭越显著。研究者常将RRA score排序后的Top基因（如Top 10）作为候选基因展示。示例：图1展示了RRA score排序后的Top基因 [Wang et al., Cell, 2021]。


<hr/>02 随机散点图

MAGeCK RRA算法会为正向和负向筛选分别提供RRA score、p值、FDR值和LFC值（其中LFC值相同）。可以选用-log10(p-value)、-log10(FDR)或RRA score等指标作为纵坐标，对所有基因绘制随机散点图。显著变化的基因会分布在散点图的顶部。
示例：图2展示了以-log10(RRA p-value)为纵坐标的随机散点图 [Wang et al., Sci Transl Med.,2021]。


<hr/>03 基于差异值的Rank图

与RRA score（范围0-1）不同，如果筛选参数数值呈对称分布（如MAGeCK RRA输出的LFC值或MAGeCK MLE算法提供的差异β值（实验组 - 对照组）），则可以绘制双向排序图（Rank图）。这种图能直观展示正向和负向筛选中均显著变化的基因。示例：图3展示了基于差异CERES值绘制的Rank图 [Takahiro et al., Nat Genet.,2021]。



<hr/>04 火山图

火山图是展示差异分析结果的常用方法。利用MAGeCK RRA提供的LFC值和p值（需注意：同一基因有正向p值pos.p和负向p值neg.p），可将LFC > 0的基因使用pos.p，LFC < 0的基因使用neg.p绘制火山图。图中横轴通常代表LFC，纵轴代表-log10(p-value)，能同时清晰展示正向和负向筛选中的Top Hits。
示例：图4展示了火山图在CRISPR筛选Top基因中的应用 [Jia et al., Cell Stem Cell. 2022]。


05 九宫格图

这种图常用于比较不同实验条件下的筛选结果（如不同药物浓度、不同时间点）。基于MAGeCK MLE算法输出的β值，可以设定阈值将基因分为不同类别（如只在条件A显著、只在条件B显著、在两者均显著等），并展示在九宫格中。
示例：图5展示了基于MAGeCK MLE β值绘制的九宫格图 [Feng et al., Protein Cell,2022]。


<hr/>06 对角线火山图

这是一种特殊形式的火山图，尤其适用于展示对照组与实验组的比较结果。它基于MAGeCK MLE的β score，使用CutoffCalling函数（例如设定scale_cutoff=2）自动确定正向和负向筛选的阈值。结果以对角线划分区域，红色区域的基因敲除后倾向于耐药（或耐受筛选压力），蓝色区域的基因敲除后则对压力更敏感。示例：图6展示了对角线火山图 [Wang et al., Nat Protoc.,2019]。


<hr/>07 sgRNA分布图

针对感兴趣的Top基因，研究者常展示其靶向sgRNA的变化情况。以每个sgRNA的LFC值为依据，绘制每个基因所有靶向sgRNA的LFC分布（如小提琴图、点图或条带图）。sgRNA的表现趋势越一致（如所有sgRNA的LFC均显著为正或负），表明该基因的功能效应越可靠。示例：图7C展示了特定基因的sgRNA LFC分布情况 [Cortez et al., Nature,2020]。


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