怎样看待nature biotechnology报道DirectGenomics的三代测序仪？

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去年瀚海基因发布三代单分子测序仪原理样机后，nature biotechnology刚刚出的这期新闻也报道了大家怎么看http://www.nature.com/nbt/journal/v34/n2/full/nbt0216-122b.html
原文地址：https://www.zhihu.com/question/40389255

卡卡

在分子生物学领域，mRNA的可变聚腺苷酸化（Alternative Polyadenylation, APA）是一个关键的转录后调控机制，它通过在mRNA的3′端添加不同长度的聚腺苷酸尾（poly(A) tail），生成具有不同3′非翻译区（3′UTR）的mRNA异构体。这一过程不仅影响mRNA的稳定性、翻译效率，还涉及蛋白质的亚细胞定位和功能调控。今天，我们将深入探讨APA的机制、功能以及其在疾病中的作用，帮助科研人员更好地理解这一复杂而精妙的生物学过程。
一、研究背景与团队介绍

本文的核心内容来自《Nature Reviews Molecular Cell Biology》杂志2022年12月发表的一篇综述文章，题为“Context-specific regulation and function of mRNA alternative polyadenylation”。该研究由美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center）的Christine Mayr团队完成。


二、APA的基本概念与机制

（一）APA的定义与重要性

APA是一种广泛存在于真核生物中的转录后调控机制。在基因转录过程中，RNA聚合酶II（Pol II）合成的前体mRNA（pre-mRNA）需要经过一系列加工步骤，才能成为成熟的mRNA。这些加工步骤包括5′端的加帽（capping）、内含子的剪接（splicing）以及3′端的切割和聚腺苷酸化（cleavage and polyadenylation, CPA）。APA的核心在于，同一个基因的mRNA可以在3′端选择不同的聚腺苷酸化位点（polyadenylation sites, PASs），从而产生具有不同3′UTR的mRNA异构体（图1A）。这些异构体虽然编码相同的蛋白质，但由于3′UTR的不同，它们在mRNA稳定性、翻译效率、蛋白质亚细胞定位等方面可能存在显著差异。
例如，某些mRNA异构体可能因为3′UTR中存在特定的miRNA结合位点而被降解得更快，而另一些异构体则可能因为缺乏这些结合位点而更加稳定。此外，3′UTR中的序列还可以影响mRNA的核输出、细胞质中的定位以及与其他RNA结合蛋白的相互作用。因此，APA不仅是一种基因表达调控机制，还涉及到蛋白质功能的精细调控。
（二）APA的分子机制

APA的调控涉及到多种分子机制，包括顺式作用元件（cis-regulatory elements）和反式作用因子（trans-acting factors）的相互作用。顺式作用元件主要指mRNA序列中的特定RNA序列，如PAS六聚体（AAUAAA或其变体）、上游元件（UGUA）和下游元件（G+U-rich或U-rich区域）。这些元件通过与反式作用因子相互作用，调控CPA的效率和位点选择（图1B，图1C）。



图1

反式作用因子主要包括CPA特异性因子（CPSF）、剪接因子（如U1 snRNP）、其他RNA结合蛋白以及与Pol II相关的转录因子。这些因子在转录过程中与新生RNA结合，调控PAS的识别和切割。例如，CPSF能够识别PAS六聚体，而剪接因子U1 snRNP则通过与内含子中的特定序列结合，抑制内含子PAS的使用，从而促进全长mRNA的生成（图1C）。
此外，Pol II的转录动力学也在APA调控中起着关键作用。Pol II的暂停、回溯以及转录终止因子的活性，都会影响PAS的选择。例如，Pol II在基因体内的暂停可能导致转录提前终止，增加近端PAS的使用频率（图2A）。而某些DNA序列（如G-quadruplex）或染色质结构的变化，也可能通过影响Pol II的转录动力学，间接调控APA（图2B）。



图2

三、APA的细胞特异性与基因特异性调控

（一）细胞特异性调控

APA的表达具有高度的细胞特异性，不同细胞类型在不同发育阶段或生理状态下，会表现出不同的APA模式。这种细胞特异性调控主要通过细胞类型特异性的转录因子、RNA结合蛋白以及染色质修饰因子来实现。例如，在神经元发育过程中，某些转录因子和RNA结合蛋白的表达水平会发生变化，从而影响特定基因的APA模式（图3A）。
（二）基因特异性调控

除了细胞特异性调控外，APA还受到基因特异性因素的影响。一些基因的启动子区域含有特定的顺式作用元件，这些元件能够招募特定的转录因子或RNA结合蛋白，从而影响该基因的APA模式。此外，基因的转录起始位点（TSS）和增强子区域也可能通过影响Pol II的转录动力学，间接调控APA。例如，某些增强子区域的激活可能导致Pol II在基因体内的暂停或回溯，从而影响PAS的选择（图3B）。



图3

四、APA的功能与生物学意义

（一）调控mRNA稳定性与翻译效率

APA通过改变mRNA的3′UTR长度，影响mRNA的稳定性和翻译效率。一般来说，较长的3′UTR可能包含更多的miRNA结合位点和RNA结合蛋白结合位点，从而导致mRNA的降解速度加快。而较短的3′UTR则可能因为缺乏这些调控元件而更加稳定。例如，在某些癌症细胞中，由于APA的失调，某些癌基因的mRNA生成了较短的3′UTR异构体，从而逃避了miRNA的抑制，导致蛋白质过度表达（图4A）。
（二）影响蛋白质亚细胞定位

APA还能够通过调控mRNA的3′UTR序列，影响蛋白质的亚细胞定位。某些3′UTR序列包含特定的mRNA定位信号，这些信号可以引导mRNA在细胞内的特定区域进行翻译，从而实现蛋白质的亚细胞定位。例如，在神经元中，某些mRNA的3′UTR包含轴突或树突定位信号，这些信号可以引导mRNA在轴突或树突中进行局部翻译，从而支持神经元的突触可塑性和信号传导（图4B）。
（三）调控蛋白质功能

APA不仅影响mRNA的稳定性和翻译效率，还能够通过调控蛋白质的亚细胞定位和与其他蛋白质的相互作用，影响蛋白质的功能。例如，某些蛋白质的3′UTR序列可以促进蛋白质与其他蛋白质的相互作用，从而形成特定的蛋白质复合体。这些复合体的功能可能与单独的蛋白质功能有所不同。例如，BIRC3基因的长3′UTR异构体可以与其他蛋白质形成复合体，从而调控细胞凋亡和迁移（图4C）。



图4

五、APA在疾病中的作用

（一）癌症中的APA失调

APA在癌症发生和发展中扮演着重要角色。许多癌症细胞表现出APA失调，导致3′UTR短化的mRNA异构体大量增加。这种3′UTR短化可能使癌基因mRNA逃避miRNA的抑制，从而导致蛋白质过度表达，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。例如，NUDT21（CPSF5）基因的表达下调会导致3′UTR短化，增强RAS信号通路的活性，从而促进肿瘤的发生和发展（图5）。



图5

（二）神经退行性疾病中的APA失调

APA失调也与神经退行性疾病的发生有关。在某些神经退行性疾病中，APA的失调可能导致某些神经保护基因的mRNA生成了较短的3′UTR异构体，从而降低了这些基因的表达水平，导致神经元损伤和死亡。例如，在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中，FUS基因的APA失调可能导致FUS蛋白的异常表达，从而影响神经元的正常功能。
六、APA研究的新技术与方法

（一）单细胞RNA测序（scRNA-seq）

单细胞RNA测序技术的发展为APA研究带来了新的机遇。通过单细胞RNA测序，研究人员可以在单细胞水平上分析APA模式，揭示不同细胞类型和发育阶段的APA变化。
（二）CRISPR-Cas基因编辑技术

CRISPR-Cas基因编辑技术为APA的功能研究提供了强大的工具。研究人员可以通过CRISPR-Cas技术精确地编辑PAS序列或删除特定的3′UTR区域，从而研究APA对基因表达和蛋白质功能的影响。例如，在CRISPR–iPAS中，催化失活的RNA特异性Cas13在近端PAS上的特定位点募集，似乎阻止了CPA因子的进入，并使APA偏向远端PAS的使用158（图6A)。相反，在CRISPRpas中，通过将DNA特异性催化失活的Cas9募集到PAS下游的序列，增强了近端PAS的使用54（图6B)。据认为，Cas9的路障导致转录复合体Pol II暂停并脱离，这似乎特别有利于增加弱PAS的使用。此外，CRISPR-Cas技术还可以用于筛选影响APA的顺式作用元件和反式作用因子，为揭示APA调控网络提供了新的思路和方法。



图6

（三）APA定量分析工具

随着高通量测序技术的发展，研究人员开发了一系列用于定量分析APA的工具和方法。例如，scUTRquant是一种基于单细胞RNA测序数据的APA定量分析工具，能够准确地定量不同细胞类型中的APA模式。这些工具的开发和应用，极大地促进了APA研究的进展，使得研究人员能够更深入地了解APA在不同生物学过程中的作用。
七、APA在药物研发中的潜力

APA失调在多种疾病中都扮演着关键角色，因此，APA调控机制的深入研究为药物研发提供了新的靶点。研究人员正在探索通过小分子化合物或RNA干扰技术来调控APA，以治疗癌症、神经退行性疾病等疾病。例如，一些小分子化合物能够特异性地结合到PAS序列或CPA复合体，从而调控APA的效率和位点选择。此外，研究人员还在探索利用CRISPR-Cas技术进行基因编辑，以纠正APA失调导致的疾病。
八、APA研究的挑战与未来方向

尽管APA研究取得了显著进展，但仍面临一些挑战。首先，APA调控网络复杂，涉及多种分子机制和细胞类型特异性因素，因此，需要进一步深入研究APA的调控机制。其次，APA在不同疾病中的作用机制尚不完全清楚，需要进一步探索APA与疾病发生发展的关系。此外，APA调控机制的复杂性也给药物研发带来了挑战，需要开发更有效的药物靶点和治疗策略。
未来，APA研究将朝着以下几个方向发展。首先，研究人员将进一步深入研究APA的调控机制，探索APA在不同生物学过程中的作用。其次，研究人员将利用CRISPR-Cas技术等基因编辑工具，进行功能基因组学研究，揭示APA调控网络。此外，研究人员还将探索APA在疾病中的作用机制，开发新的药物靶点和治疗策略。最后，随着单细胞测序技术的发展，研究人员将利用单细胞测序技术，深入研究APA在不同细胞类型和发育阶段中的作用。
总之，APA作为一种重要的基因表达调控机制，在生物学和医学研究中具有重要意义。通过深入研究APA的调控机制和功能，我们可以更好地理解基因表达调控的复杂性，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
九、结语

APA作为一种复杂的基因表达调控机制，在生物学和医学研究中具有重要意义。从基础的分子机制到临床应用，APA的研究为我们提供了对基因表达调控的深刻理解。通过深入研究APA的调控机制和功能，我们可以更好地理解基因表达调控的复杂性，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。未来，随着新技术和新方法的发展，APA研究将取得更多突破，为生物学和医学研究带来新的机遇。
参考文献：
Mitschka, S., Mayr, C. Context-specific regulation and function of mRNA alternative polyadenylation. Nat Rev Mol Cell Biol 23, 779–796 (2022). https://doi.org/10.1038/s41580-022-00507-5

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长长的路

瀚海买是Helicos Biosciences的测序仪专利，在这个平台上做一些优化。Helicos是单分子测序，用的是边合成边测序（SBS）的测序原理。这个平台天生的缺点就是

• 速度慢（每个碱基位点测序，要30分钟）：这个基本提升不了
  
• 读长短：因为测序速度太慢，为了在一定时间出结果，只能牺牲读长
  
• 错误率高：这个也许可以通过改变荧光染料的强度，获得大幅提高。但应该达不到簇cluster测序的信噪比。
  
• 通量低：这个也许可以通过改造流动槽（flowcell）设计制造的到提升
  

总之，基于这个平台的特性／局限，做一些特殊应用（微量RNA-Seq）应该有不少斩获。但舍弃自己的长处，去拼临床市场，实在是得不偿失。

检验医师

先匿了吧。。
其一、利用SBS技术，在使用PCR扩增后自身的错误率都会有0.1%-1%；
如果不进行PCR，单分子测序，对光敏和错误率上面来说，还有一条比较远的路要走。
其二、通量上很低，低到什么地步呢？10M左右的测序数据，无法适应很多临床的需求。
其三、一台机器的产出到成型，没几亿砸进去，是见不到好机器的，目前瀚海基因应该还没那么大的魄力这么大投入。
所以……就看看吧……
生物行业发展那么快，等他出来，预计都得三四年后了，谁能保证会发生什么？