RT-PCR的原理是什么？有何用途？

病理医师

RT-PCR的原理是什么？有何用途？
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大力水手

RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种实验技术，用于检测和量化RNA分子。
RT-PCR的原理如下：
1. 逆转录（Reverse Transcription）：首先，通过逆转录酶（Reverse Transcriptase）将RNA转录成相应的互补DNA，即cDNA（互补DNA）。
2. 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）：然后，在PCR反应中利用DNA聚合酶酶将cDNA模板进行多轮扩增。该反应通过有选择性的引物（primers）选择特定的目标序列，将其复制成大量的DNA分子。
RT-PCR的用途如下：
1. 检测和研究疾病：RT-PCR可以用于检测和研究不同疾病的相关基因或病原体的RNA，从而确定其存在和数量。
2. 病毒检测：RT-PCR是检测病毒感染的常用方法，可以确定是否存在病毒RNA，并可以对其进行定量分析。
3. 基因表达分析：RT-PCR可以用于测定特定基因的表达水平，从而了解该基因在生理或病理条件下的调控和功能。
4. 遗传疾病筛查：RT-PCR可以用于检测和筛查某些遗传疾病相关的基因突变或异常，从而进行早期诊断和预防。
总之，RT-PCR在生命科学研究和临床诊断中具有广泛的应用，可用于检测、定量和研究RNA分子。
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科学对话 (medpeer.cn)
prompt：RT-PCR的原理是什么？有何用途？
模型：ChatGPT Pro

队长是我

RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。[1]
原理是提取组织或细胞中的总RNA或者mRNA，在反转录酶的作用下将RNA或者mRNA反转录成cDNA，再以该cDNA第一链为模板进行PCR扩增，根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物，基因特异的上游引物与cDNA第一链退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板，用基因特异的上下游引物PCR扩增获得大量的cDNA。[2]


Real-time PCR（实时荧光定量PCR）也可以缩写为RT—PCR，此外还有一个qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ），有人可能将这三者搞混。
其实Rea-ltime-PCR和 qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ）都是指实时定量PCR，即在PCR进行的同时，对其过程进行实时监测，可以对起始模板数量进行精确的分析。并且国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为 qPCR（quantitative real-time PCR）。
RT-PCR的方法已经广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。[3]

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荧光定量PCR目的：在PCR反应中，无论是定性还是定量分析，分析的都是PCR的终产物。但是有时候想知道的却是未经PCR放大之前的起始模板量，RT-PCR应用而生。
原理:


图一




图二
如图2 Taqmen 探针，5’端标记有报告基团R可发出荧光信号 ，3’端标记有荧光淬灭基团Q可吸收荧光信号。探针的本质就是一寡核苷酸链。
如图1 在PCR的反应过程中加入一寡核苷酸链（DNA/RNA），我们称之为探针。当探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收，从而不被检测出来。当PCR扩增至探针所在位置时，Taq DNA聚合酶具有的核酸外切酶活性会将探针5’端的报告基团切断，使其远离探针本身，这时产生的荧光信号就不能被淬灭基团吸收，而被仪器检测出来。每扩增一条DNA链就会有一个荧光分子产生，通过荧光信号的积累量实时监测整个PCR反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。注意这里的Taq聚合酶不能随便选择，荧光定量PCR的Taq酶一定要有5‘-3’的核酸外切酶活性，且最好是hot start taq酶，扩增不需在冰上操作，且扩增特异性 灵敏度有保证