如何高效率进行细胞钙离子的标记

生物科研实验室

细胞钙离子作为广泛存在的第二信使在细胞信号转导和调节靶细胞的活性中发挥关键作用。当细胞内钙离子浓度失衡将可能诱导细胞凋亡，钙离子区域浓度即钙稳态的维持主要依靠内质网及线粒体等细胞器以及相应的调节通道。内质网作为细胞内重要的钙离子储存库，在维持钙稳态方面发挥着举足轻重的作用。线粒体则是临时的钙储存库，充当细胞钙信号的翻译器。过量的线粒体耗蓄积可导至线粒体转换通透孔 mPTP开放导至细胞色素Ｃ和调亡诱导因子等促凋亡因子外流，激活Caspase-3依赖的细胞内凋亡通路。

准确地检测和分析细胞内钙离子浓度变化，对于深入理解细胞各种生理和病理过程具有极其重要的意义。细胞内钙离子的常见检测方法主要有荧光探针法，那么如何能高效的使用荧光探针来进行标记呢？

Q 1：常见的细胞钙离子探针有哪些？

常用的Ca2+荧光探针根据波长的不同，分为可见光激发以及紫外光激发，用于成像推荐可见光激发的Fluo-3、Fluo-4剂Fluo-8系列的探针；紫外激发的Fura-2及Indo-1属于双波长激发（发射）的钙离子指示剂，其激发（发射）特性与Ca2+浓度有关。

Q2：检测内质网及线粒体钙离子的荧光探针可以选哪些呢？

内质网钙离子检测常见为Fluo-5N，AM，线粒体钙离子检测常见为Rhod-2，AM。参考：Ca2+Imaging of Intracellular Organelles: Endoplasmic Reticulum，

Q 3：钙离子荧光探针中AM是什么？ AM为acetoxymethyl ester乙酰氧基甲酯，能够帮助探针渗透细胞，更容易载入到细胞中，进入细胞后AM基团被酯酶水解，因此在稀释钙离子探针时切不可含血清。

Q4：使用钙离子荧光探针进行孵育时该如何选择稀释液呢？ 常用稀释液为HHBS（HBSS中添加10 mM HEPES），具体配方为：Hank's buffered salt solution (HBSS) (in mM):137 NaCl, 5.4 KCl, 0.25 Na2HPO4, 0.44 KH2PO4, 1.3 CaCl2, 1.0 MgSO4, 1.0 MgCl2, 10 glucose, 10 HEPES, with pH adjusted to 7.4 using 1N NaOH 其它如PBS及【无血清】培养基均是可行的。

Q5：是否一定需要Pluronic F-127？ 非离子洗涤剂Pluronic F-127有助于非极性AM酯在水介质中的分散，因此非常需要使用Pluronic F-12，推荐终浓度为0.04%（万分之四），最高不超过0.1%（千分之一）。

Q6：是否一定需要probenecid丙磺舒？ 并非一定需要probenecid丙磺舒，但对于部分细胞，添加和不添加的区别非常明显

Q7：孵育温度和孵育时间该如何选择？一定有必要在完成孵育后再进行去酯化吗？ 孵育温度是室温或37℃，孵育时间通常为30min，可适当延长孵育时间。孵育的工作浓度常见为1-5 μM，但对于特殊样本如植物组织样本则推荐使用不低于20μM的工作浓度。探针孵育完成后即可进行检测，去酯化为非必要操作。

Q8：染色完成后可以进行固定或通透吗？是否还可以进行免疫荧光？ 染色完成后不可进行固定、通透及免疫荧光染色。钙离子荧光探针如Fluo-3及Fluo-4荧光并不能持续较长时间，探针孵育结束后需要在活细胞状态下尽快检测。