PCR实验全攻略：从原理到操作，一篇搞定

幸福侠侣

PCR实验原理聚合酶链式反应（PolymerasChainReaction,PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的技术，通过模拟DNA天然复制过程，利用引物、DNA聚合酶和dNTP实现目标序列的指数级扩增。核心步骤是变性（Denaturation）是高温（95℃）使双链DNA解链为单链。退火（Annealing）：降温（50-65℃）使引物与模板DNA互补结合。延伸（Extension）是中温（72℃）下DNA聚合酶沿模板合成新链。循环重复是每轮循环使目标DNA量翻倍一般30~35个循环实验步骤试剂准备
5个基本组分模板DNA（1-100ng）（一般是从细胞/组织中提取RNA，反转录成cDNA进行PCR实验）引物（Forward/Reverse，终浓度0.1-1μMdNTPs（终浓度0.2mMaqDNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶）缓冲液含Mg²⁺，通常10×浓度。配制体系按比例混合各组分（如总体积25-50μl），避免反复冻融试剂。关键点在冰上操作，防止酶提前失活；设置阴性对照（无模板）排除污染。PCR程序设置标准三步法（以30~35个循环数为例预变性95℃,5min（确保模板完全解链）。
循环阶段变性是95℃,30sec退火：55℃（依引物Tm值调整）,延伸：72℃,1min/kb（按目标片段长度计算）终延伸：72℃,5-10min补全未延伸的DNA链。保存：4℃保存。（有些仪器设置16℃保存，从仪器取出后放在4℃保存，但需尽快检测）关键技巧与优化策略引物设计基本原则是长度：18-25bp，GC含量40-60%。Tm值：上下游引物差异≤2℃，可用公式是Tm4(G+C)+2(A+T)。避免二聚体及发夹结构面试中常问问题！！！你是否做过PCR实验、是否设计过引物、是否知道引物设计的原则、常用的检测引物是否设计成功的方法。
希望我的介绍对你有帮助。

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