BCA法测蛋白浓度法原理和试剂盒说明书

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BCA法测蛋白浓度是通过比色检测进行总蛋白质定量的常用方法。相比基于考马斯染料的定量方法（Bradford 法定量）,Pierce BCA 蛋白定量试剂具有独特的优势，因为它们可以兼容含有多达 5％ 表面活性剂（去垢剂）的蛋白样品，并且受蛋白组成差异的影响小得多，从而具有更高的蛋白间均一性。
赛默飞最新推出的内含免稀释蛋白标准品的 BCA 蛋白定量试剂盒最多可将实验时间缩短80%。免稀释蛋白标准品是一组与排枪兼容的预稀释标准品，使您可以轻松地将稀释好的标准品一步转移到微孔板中。
赛默飞提供BCA蛋白定量和Lowry蛋白定量产品，请访问赛默飞官网获取产品最新信息。根据您的蛋白样品选择合适的BCA蛋白定量试剂盒。
BCA 蛋白定量试剂盒概述

• 免稀释Rapid Gold BCA 快速蛋白定量试剂盒——绿色至黄色（A480 nm），双组分的精确定量试剂，兼容去垢剂，仅需室温下孵育5分钟，即可测定总蛋白与蛋白质标准品的浓度。
  
• BCA 蛋白定量试剂盒（内含免稀释标准品）——绿色至紫色（A562 nm），双组分的精确定量试剂，兼容去垢剂，37°C下孵育30分钟以检测总蛋白质浓度与蛋白质标准品。
  
• 还原剂兼容型 BCA 蛋白定量试剂——经典 BCA 试剂盒的还原剂兼容型版本 ，用于测量含有 DTT 或 BME 硫醇还原剂的样品的蛋白浓度。
  
• 微量 BCA 蛋白定量试剂——三组分 BCA 试剂盒，专门用于测量稀释蛋白溶液（0.5 至 20 μg/mL）中的总蛋白浓度。
  

轻松、快速、准确

热门BCA 蛋白定量试剂盒现自带免稀释 BSA 蛋白标准品——7个浓度的预稀释BSA标准品，专为排枪设计。


Pierce 免稀释蛋白定量产品可大幅减少传统定量实验中繁琐的稀释操作，并使用来自美国国家标准与技术研究院 (NIST) 的纯化 BSA进行校准，以确保标准曲线的准确性。
BCA法测蛋白浓度法原理

BCA 蛋白定量的化学反应

Pierce BCA 蛋白定量试剂通过在碱性环境中用蛋白质将 Cu2+ 还原为 Cu+（广为人知的双缩脲反应），然后通过二辛可宁酸（BCA）对亚铜阳离子（Cu+）进行高灵敏度和高选择性的比色检测。


图 1.第一步：将铜与碱性环境中的蛋白质螯合，形成蓝色复合物。在此反应中，含有三个或三个以上氨基酸残基的肽与含酒石酸钠钾的碱性环境中的二价铜离子形成有色螯合物。
单个氨基酸和二肽在双缩脲反应中不受影响，但三肽以及更大的多肽或蛋白质会发生反应，产生吸收峰位于 540 nm 的淡蓝色至篮紫色复合物。一个二价铜离子与附近四到六个多肽结合形成有色螯合物。产生的颜色强度与参与反应的肽键数目成正比。


图 2.第二步：BCA 试剂是一种高灵敏度、高选择性的比色检测试剂，与第一步形成的亚铜阳离子（Cu+）反应，产生紫色。
BCA– 铜复合物是水溶性的，在 562 nm 处具有强线性吸收，吸收度随蛋白浓度增加而升高。在 550 至 570 nm 波长范围内，可对紫色进行测量，此范围内信号丢失最小（少于10 %）。BCA 试剂产生的信号约比使用双缩脲试剂产生的信号灵敏100 倍（检测下限更低）。
Pierce 免稀释Rapid Gold BCA 蛋白定量试剂采用与经典 BCA 定量试剂相同的铜离子还原法，并含有独特的铜螯合剂。在显色反应的第二步中，Pierce 免稀释Rapid Gold BCA 螯合剂与第一步还原产生的亚铜阳离子（Cu+）反应，产生一种深金色反应产物。此铜复合物随着蛋白浓度的增加，在 480 nm 波长处表现出强烈的线性吸光度。
免稀释 BCA 蛋白定量

免稀释 BSA 蛋白标准品可单独购买，部分热门BCA蛋白定量试剂盒里面已内含免稀释标准品。与 Bradford法或 Pierce BCA Protein Assay 试剂盒相比，免稀释Rapid Gold BCA 蛋白定量试剂盒无需稀释样品和标准品，从而可将实验时间减少高达 80%。 此外，它只需要 5 分钟的室温孵育。 经典BCA试剂盒也有内含免稀释 BSA 蛋白标准品的版本—— Pierce 免稀释BCA Protein Assay 试剂盒。


图 3. 与其他蛋白质检测相比，Pierce 免稀释Rapid Gold BCA蛋白定量试剂盒最高可将实验时间缩短 80%。 按照说明书中的方案在微孔板中进行实验。 样品共10个：5个细胞裂解物样品、5个纯化蛋白样品。BCA 和 Bradford 法的标准曲线是通过连续稀释 2 mg/mL 牛血清白蛋白 (BSA) 标准品生成的。Pierce 免稀释Rapid Gold BCA 蛋白定量试剂盒的标准曲线是使用内含的兼容排枪的Pierce 免稀释 BSA 蛋白标准品生成的。十个样品中的四个预计起始浓度 > 2 mg/mL，因此BCA 和 Bradford 法需要进行样品稀释，但免稀释Rapid Gold BCA 试剂盒不需要稀释样品。然后将样品与各个试剂盒的工作试剂混合并按照说明书进行孵育。
BCA法测蛋白浓度的优点

BCA法蛋白定量

BCA 法定量的主要优点之一是它可产生一条线性响应曲线。此响应曲线有助于准确测定未知蛋白的浓度，并具有比其他常规定量方法更宽的动态范围。


图 4. Pierce 免稀释Rapid Gold BCA 蛋白定量试剂盒可在宽动态范围 (0–10 mg/mL) 内生成线性标准曲线。 使用溶于0.9% 生理盐水中的纯化 BSA (0–10 mg/mL) 为 Pierce 免稀释Rapid Gold BCA 蛋白定量试剂盒和Quick Start Bradford 蛋白定量试剂盒 (Bio-Rad) 制作标准曲线。 两种方法均按照说明书中的方案在微孔板中进行实验。 使用 Thermo Scientific Varioskan LUX 多功能酶标仪读取吸光度数据。
BCA法测蛋白浓度的准确度

BCA 法蛋白定量的另一个主要优点是蛋白间差异较低。蛋白的组成和结构具有高多样性，在一些检测中，蛋白在氨基酸序列、等电点（ pI ）、二级结构和侧链或辅基上的差异会导致比色响应的差异。由于蛋白间差异较低，BCA 蛋白定量方法能够更准确地测定未知样品的蛋白浓度。


图 5. Pierce 免稀释Rapid Gold BCA 蛋白定量试剂盒和Quick Start Bradford 蛋白定量试剂盒的实验结果与样品的已知浓度对比。两种方法均按照说明书中的方案在微孔板中进行实验。对于 Bradford 法，将 5 μL 样品添加到 250 μL Bradford 工作试剂中，并在室温下孵育 5 分钟。 对于免稀释Rapid Gold BCA 法，将10 μL 样品添加到200 μL 免稀释Rapid Gold BCA 工作试剂中，并在室温下孵育5 分钟。 蛋白样品的已知浓度信息来自厂家，并通过 280 nm 处的吸光度进行确认。
BCA 蛋白定量实验方案

使用免稀释 BSA 蛋白标准品进行 BCA 蛋白定量

Pierce BCA 蛋白定量试剂产生线性响应曲线（R2 > 0.95），可根据检测未知样品蛋白浓度所需的动态范围，选用两种不同的方案进行检测。标准 Pierce BCA 蛋白定量试剂使用双组分系统检测 20 至 2000 μg/mL 的蛋白质浓度：试剂 A 是含有 BCA 试剂的碳酸盐缓冲液，试剂 B 是一种硫酸铜溶液，两者结合制成一种苹果绿色的工作溶液，在蛋白存在的情况下，30 分钟后在 37℃ 下变成紫色。由于颜色反应不是真正的终点反应，Pierce BCA 蛋白定量具有相当大的实验方案灵活性。可以通过增加孵育温度提高检测的灵敏度。使用增强型试管方案（即在 60°C 下孵育 30 分钟）时，检测工作范围变化为 5–250 μg/mL，可实现稀释蛋白样品的准确定量。


图 6. BCA 蛋白定量试剂盒（内含免稀释标准品）搭配排枪进行蛋白定量实验。
Rapid Gold BCA 蛋白定量试剂盒的实验方案

该比色测定法延续了 BCA 定量的高灵敏度和线性度，极大缩短孵育时间，可以更快地进行标准 BCA 定量操作。该方法可在室温下于 5 分钟内完成孵育，无需长时间等待或者将样品置于高温下。


图 7. 免稀释 Rapid Gold BCA 蛋白定量试剂盒实验方案。
BCA法测蛋白浓度常见问题：

Q. 哪些物质会干扰BCA定量分析的结果？

A. 部分干扰 BCA 定量分析的物质包括还原性物质、螯合剂以及强酸或强碱，即使浓度很低也可能会影响定量的结果。
另外，一些物质对 BCA 定量分析方法的干扰程度较低，当其在原始样本中含量低于某特定浓度时，仅对结果造成微小影响（可耐受）。此外，多种干扰物质可能产生加和作用，例如当样本缓冲液中含有多种干扰物质时，即使其中单一干扰物质的浓度低于可兼容浓度，总体仍有可能对蛋白质的定量分析产生干扰。
Q. BCA法与Bradford法应如何选择？

A. 主要由样本中的干扰物质决定。如果你的蛋白抽提试剂中含有大量去垢剂且不含有螯合剂、还原剂时，可使用BCA法；如果你的蛋白里含有EDTA等金属螯合剂或者含有还原型物质，且不含有去垢剂时，可使用Bradford法。
Q. 蛋白抽提完是否可以直接蛋白定量？

A. 依据测试过的数据，Thermo Scientific M-PER， RIPA总蛋白抽提试剂，Mem-PER Plus膜蛋白抽提试剂，NE-PER核蛋白抽提试剂，亚细胞组分分离试剂盒等均可直接使用BCA进行蛋白定量，T-PER抽提后 的蛋白经过稀释可使用BCA进行定量。
Q. BCA法能检测多肽浓度吗？

A. 不能，检测多肽浓度需要用专门的多肽浓度检测试剂盒，如Pierce™ Quantitative Fluorometric Peptide Assay（货号23290），或Pierce™ Quantitative Colorimetric Peptide Assay（货号23275）。
Q. BCA法需要孵育至少30分钟，有没有更快的方法？

A. 全新Pierce 快速Gold BCA试剂盒（货号A53225， A53226），只需孵育5分钟，室温下即可进行。此外，Gold BCA试剂盒保留了经典BCA法的高线性、高去垢剂兼容性和低蛋白差异性，使用更加快捷、简便。
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如需了解完整的实验方案，请查阅BCA法测蛋白浓度试剂盒说明书或登录赛默飞官网下载电子版说明书。

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