western blot转膜？

青草

做western bolt转膜的时候，300mA，1.5h，刚开始放冰袋了，中间没有换冰袋，等转完的时候，电泳槽里面的缓冲液都变热了，冰袋全化了，但是膜上的marker很工整，就是平时转完的样子，胶也未发现变形，请问对蛋白条带会有影响吗？，会不会蛋白扩散或者变性检测不出来了？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/271740483

同花顺

Western blot，不推荐整膜带marker的理由-1, 真实WB/ Western blot欢迎垂询交流~ykt3728
越来越多的SCI要求：内参和目的蛋白在同一张膜上，尽量不跑平行胶，因为操作的不一致性可能影响定量结果的准确性。因此，在泳道安排合理一致的情况下，是可以裁剪PVDF或NC膜的。原始无裁剪的gel/blots图中“裁剪”指的是在Ai或者PS作图过程中的裁剪，说白了就是让你提供每个条带作图前的原始图。反驳二：一图胜前言，就以最新的大名鼎鼎nature cell biology（双一区，IF=28.213）的文章举例，“Nuclear condensates of YAP fusion proteins alter transcription to drive ependymoma tumourigenesis”（Nat Cell Biol. 2023 Feb;25(2):323-336. doi: 10.1038/s41556-022-01069-6.）里展示的原始无裁剪的gel/blots图。










Western blot，不推荐整膜带marker的理由-2,
而整膜带marker，这时候就“可能”需要对膜stripping，然后孵育第二种甚至反复到第三种抗体，Stripping排除其他的不讲，整个流程会耗费不少的时间，从节约时间的角度来讲能不做最好；并且stripping条件过于激烈或多轮洗脱时，还会剥离已转印到膜表面的抗原使WB的最终信号削弱；此外，stripping buffer未清除干净时，其中的某些组分一定会干扰第二种抗体的结合。因此，实际操作过程中，所谓“未裁剪”的整张PVDF或NC膜，往往只孵育了一种抗体，内参和目的蛋白不在同一张膜上，这就是典型的平行胶，可信度还不及切膜孵不同抗体。反驳三：一图胜前言，就以最新的大名鼎鼎nature cell biology（双一区，IF=28.213）的文章举例，“A neurodevelopmental epigenetic programme mediated by SMARCD3-DAB1-Reelin signalling is hijacked to promote medulloblastoma metastasis”（Nat Cell Biol. 2023 Mar;25(3):493-507. doi: 10.1038/s41556-023-01093-0.）里展示的原始无裁剪的gel/blots图。








Western blot，不推荐整膜带marker的理由-3, 真实WB/ Western blot欢迎垂询交流~
因此SCI要求：原始无裁剪的gel/blots图中“裁剪”指的是在Ai或者PS作图过程中的裁剪，而非WB实操过程的“裁剪PVDF或NC膜” 反驳四：一图胜前言，就以最新的大名鼎鼎nature cell biology（双一区，IF=28.213）的文章举例，“MLL3 loss drives metastasis by promoting a hybrid epithelial-mesenchymal transition state”（Nat Cell Biol. 2023 Jan;25(1):145-158. doi: 10.1038/s41556-022-01045-0.）里展示的原始无裁剪的gel/blots图。

长长的路

最近读了博士，在做鬼才信的科研。。首先学习了，蛋白印迹实验(Western Blot)，做了个傻瓜式手账，说实话，B站那些视频用的东西太高级了。大概穷鬼课题组应该就和我们用的差别不多~~可以相互借鉴学习~~~~
步骤如下：
0.细胞计数，参照文献处理细胞（裂解之类的）
实验地点：325实验室
1. 玻璃板清洗干净过夜，
2. 玻璃卡槽固定在响应设备上



图 1 需要的东西

3. 按钮卡住
4. AP（过硫酸盐）溶液配置（100ng/mL），使用去离子水
5. 配胶：准备A\B上下层预制胶溶液。下层胶配置：4mLA+4mLB 加80uL的AP。混合吹打（注意：动作要快，防止干住）
6. 两边板子加胶，水封加满，等待10min，凝固
7. 取出目的蛋白和Mark，还有内参，回复至室温
8. 装置倒出水，滤纸尽量吸干。
9. 配上层绞，2mLA+2mLB，+40uLAP
10. 上胶（插梳子），等待10min，取出梳子，吸干水分，保持样品孔成方形
11. 安装电泳仪，配置电泳缓冲液（SDS一袋到1L）
12. 电泳槽安装规则：黑对黑，红队红
13. 样品涡旋10s，上样（5uL）（1组（3个）中间空一格）
14. 按钮扭开，取出样品，放入电泳槽，中间电泳液淹没过胶板，两边到一半
15. 盖上盖子，拧上，连接电泳池



开启电源的装置图

16. 开电泳，80V电压，跑至上层胶底部，换电压，30min，换电压200V，1h
转膜
17. 准备大培养皿（TBTS）+小培养皿（甲醇）
18. 红黑甲板准备，中间放泡沫材料，泡在缓冲液中
19. 剪膜（6张）（宽度1/3）(泡在甲醇里)
20. 切胶（用绿色板挑出胶）（上层胶直接推走）
21. 切胶结束后，泡在缓冲液里，正面朝上（不太好夹，准备镊子）
22. 夹板黑在下，红在上，转膜滤纸放在夹板中。摆放过程中注意分开一点
23. 夹好，红对红，黑对黑安装，放入电泳槽
24. 拧上，连接电泳仪
25. 冰袋（冰浴）（冰水浴），防止蛋白降解，电流300mV，电压0V（时间：分子量决定，140-140分钟）
26. 脱脂奶粉配置
2500g—50mL TBST（5g/mL）
27. 停止电泳，取出
28. 封闭（先用TBTS清晰）（标记组别）4个指标
29. 加奶粉和样品到一个蓝盒子里，混合40rpm，孵育3h
30. 6个离心管
31. 脱脂奶粉稀释抗体（1抗）1000-2000倍（4mL-6mL） β-Actin（4-8mL）
32. 倒出脱脂蛋白奶粉加1抗常温20min40rpm孵育过夜后，4℃过夜
33. 加二抗孵育
34. TBTS清洗3遍，每次5min
35. 显色
36. A液+B液=1：1 （2mL+2mL）
37. 擦干晾干，显色液
38. 调整位置
39. 按Auto成像

清风寡欲

条带可能不那么好看。。

同花顺

能转上去就问题不大。
Western的本身就是已经变性蛋白了（如果前面的是SDS-PAGE的话，包括还原和非还原电泳都是已经变性的）。
检测的抗原表位对变性的应该没问题。
可以做个丽春红染色。

检验医师

蛋白marker本来就是纯化好的蛋白混合物与染料共价耦联，在跑胶和转膜供我们参考用的，蛋白maker条带在膜上完整，说明蛋白转过去了，其他样品蛋白也一样，所以没什么需要担心的；另外如果你的目标蛋白是大分子，看看你的蛋白胶有没有marker残留，通常大分子比较难转过去，如果蛋白胶上300kDa大小的条带都转到pvdf膜上了，就完全没问题。封闭敷抗体吧。