ELISA实验标准曲线不佳，怎么排查原因？

莺歌燕舞

ELISA实验标准曲线不佳，怎么排查原因？
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队长是我

如何判断我绘制的标准曲线是否有效呢？
在显色阶段，控制标准品前4孔有明显的蓝色梯度，以及标准品最大OD值≥1.2，标准曲线的线性回归相关系数R2≥0.99，即可作为有效标曲。
标准曲线的制作，可参考往期内容《ELISA实验指南！！新手必读》
但是，在ELISA实验过程中，往往有标曲异常的情况出现，下面，小E老师将介绍几种特殊情况，并将其原因与对策一一道来。
例1：整体偏低



虽然标曲有一定梯度，但是最大OD值<1.2，梯度没有拉开。

可能原因：

• 1) 试剂盒过期或保存不当；
  
• 2) 标准品未溶解完全；
  
• 3) 加入终止液后，没有立即检测；
  
• 4)  试剂盒部分试剂（特别是洗涤液）混用其他批次，或为混用外源溶剂。
  

建议：

• 1) 按照说明书保存各组分，在保质期内使用；
  
• 2) 标准品溶解前，需要离心处理(10000×g离心1分钟)，加入1.0mL标准品&样品稀释液后，静置1-2分钟，用低速涡旋仪充分混匀；
  
• 3) 加入终止液后，请立即进行检测。若需等待，放置在避光处的时间不宜超过10分钟；
  
• 4)  使用试剂盒内一套完整的试剂，不要混用其他批次或外源溶剂。
  

例2：无信号



标曲没有显色，OD值无梯度变化。

可能原因：

• 1) 试剂盒过期，或保存不当；
  
• 2) HRP酶受到污染，导致活力和效价降低；
  
• 3)  实验操作失误。例如：将生物素化抗体工作液和酶结合工作液的加样顺序颠倒；
  
• 4) 订购多个指标，实验时混用标准品、酶标板、生物素化抗体等。
  

建议：

• 为了快速排查原因，请尝试混合10μL底物溶液和2μL浓缩HRP酶，观察是否发生颜色变化，并及时对显色结果拍照。
  
• 如果有颜色变化（混用后呈现深蓝色/蓝绿色），表明HRP酶和TMB并无污染问题，可重新取一条板条，在避免以上问题的情况下制作标曲。
  

例3：整体偏高




酶标仪仪器光密度范围过广，导致检测OD值范围也很高。建议光密度范围设置在0-3.5之间。


可能原因：
部分OD值超出仪器检测范围，可能是由于工作液浓度过高，或孵育时间过长/温度过高。
建议：

• 1) 按照说明书要求，在工作液使用前15分钟，将浓缩液于800×g离心1分钟，以浓缩液：稀释液=1：99的比例，现配现用；
  
• 2) 孵育箱或烘箱需控制温度恒定37℃，温差不超过1℃，底物反应时间为15分钟左右。建议根据标准孔前4孔出现明显蓝色梯度，来控制实际显色时间，显色时间酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。
  

例4：全阳性


可能原因：

• 1) 竞争法按照夹心法操作；
  
• 2) 洗涤不当：洗涤时每孔注入的洗液不够，或洗涤次数不够；液体过多溢出污染；浸泡时间过短；
  
• 3) 显色剂保存不当，孵育时未避光，或试剂被污染等，造成非特异性显色。
  

建议：

• 1) 夹心法和竞争法原理不同，操作步骤不同，请注意区分；
  
• 2) 按照说明书中洗涤操作进行洗涤；
  
• 3) 避光保存底物溶液，使用前再拿出，避光孵育；各类试剂现用现拿，现配现用，注意枪头和加样槽的洁净，避免试剂污染。
  

以上，是小E老师分享的常见ELISA标曲异常的原因及对策。更多ELISA标曲问题排查，欢迎查看《ELISA标曲异常怎么破？特殊情况有对策！（下）》

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ELISA实验加入显色底物后，标准品有颜色，但结果分析发现标准品最高点吸光值偏低或偏高、标准曲线无梯度等等，总结如下原因：
一、 标准曲线最高点吸光值偏高，超出仪器检测范围
ELISA标准曲线最高点的吸光值一般在3.0以下，若太高超出仪器检测范围，显示OVER FLOW，可能原因：

序号	可能原因	解决方法
1	如OD绝对值靠谱，则显色过度	TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断， 当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。
2	仅作单波长检测	由于参考波长读取非特异性检测，如指纹、划痕、水渍等， 对结果也有影响。建议最终结果以双波长为最准确。

二、 标准曲线最高点吸光值偏低
ELISA标准曲线最高点的吸光值一般要在0.8以上，若小于0.8，可能的原因：

序号	可能原因	解决方法
1	粉末标准品未充分溶解	粉末标准品按说明书加一定体积的液体后，轻柔混匀， 室温静置30分钟，充分溶解。
2	标准品反复冻融	标准品反复冻融后活性降低。
3	孵育温度、时间	按说明书要求孵育条件进行孵育。
4	显色时间控制	TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断，当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。

三、标准曲线无梯度
ELISA 实验中标准品2倍倍比稀释，但结果分析标准曲线没有梯度，可能的原因：

序号	可能原因	解决方法
1	样品或标准品污染	避免污染
2	错误的样品或标准品的稀释	完全按照说明书稀释
3	偶联抗体浓度过高	按照说明书调整到最佳的浓度
4	TMB底物孵育时间过长	调整到合适的孵育时间
5	错误的孵育时间或温度	完全按照说明书
6	孵育时未加盖导致溶液挥发和污染	贴封片或加盖

总结
得到完美ELISA标准曲线，需要注意几点：
1、 充分溶解标准品；
2、 标准品避免反复冻融；
3、 梯度稀释标准品注意混匀。