【技术分享】ELISA 方法建立---棋盘滴定

临床医师

我们在建立一种ELISA方法时，对于抗原抗体最适工作浓度的选择是非常重要的，不仅可以快速摸索出ELISA的最优条件，还可以节约测定时间和成本。
下面以夹心法测抗原为例，介绍最适工作浓度的选择方法。
a.用包被缓冲液稀释单克隆抗体，浓度分别为10ug/ml、5.0ug/ml、2.5ug/ml、1.0ug/ml, 包被酶标板，每一浓度包被1横行，每孔100ul。4 ℃过夜包被，洗涤3次；
b.5%脱脂奶粉封闭酶标板， 37℃孵育1h，洗涤3次；
c.在每条包被孔中加入空白对照和标准品，每个空白对照和标准品为一组，依次加入，各100ul，37℃孵育1h，洗涤3次；
d.在每一包被浓度的一条中分别加入按1:2000、1：4000、1：8000、1:16000 稀释的兔多抗， 37℃孵育1h，洗涤3次；
e.在每一包被浓度的一条中分别加入HRP标记羊抗兔igG，稀释度先按说明书上的推荐稀释比进行稀释，37℃孵育30min，洗涤5次；
f.加TMB底物，37℃避光显色10-15min，用2mol/L H2SO4终止反应，酶标仪450nm读取吸光度（OD）值；
g.测得的标准品OD值在2.0左右，阴性对照OD值小于0.1的组合为较理想的组合。
可根据初步确定的浓度缩小间距,再做进一步棋盘滴定,寻找最佳包被条件。
注意：抗体做稀释时最好用同一个原始浓度做倍比稀释，这样可以尽量减少由于加样枪造成的误差及人为误差。
加样方法参考下表：



注：1.  1,2,3,4条分别包被不同浓度单抗，如红色框所示；2.纵列分别加入标准品和blank孔，相应加入稀释好的多抗；3.整板加入推荐稀释比的二抗。

典型数据举例如下:如 h.il-6，参考范围300pg/ml



h.il-6数据

由此表可以看出，选择包被1ug/ml，检测抗体用1：4000，效果最佳
相信经过对棋盘滴定的掌握，各种ELISA试剂盒方法建立已不成问题。

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