qPCR原理讲解和试验步骤以及“常见问题和数据结果差异分析全面讲解”

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qPCR实验原理和步骤讲解
一、qPCR原理：
qPCR（Real-time Quantitative PCR）即实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR），在PCR过程中加入荧光基团，根据荧光信号的变化实时监测扩增产物的变化。并通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

实时荧光PCR的产物不同，主要方法分为三种，DNA结合染料法、探针化学法、淬灭染料引物法。

1、DNA结合染料法：与双链DNA小沟结合的荧光染料，不与单链DNA结合，与双链DNA结合会发出荧光，从而进行实时监测。

2、探针化学法：荧光标记的探针与靶序列特异性结合产生荧光信号，利用荧光信号实时检测PCR扩增产物的变化。

3、淬灭染料引物法：使用荧光标记引物扩增，使荧光标记gene掺入到PCR扩增产物中，从而利用荧光能量共振进行传递。

二、实验步骤：

1、提取核酸：提取目标DNA或RNA。

2、反转录（RNA样本）：RNA转录成相应的cDNA。

3、预处理：纯化提取的DNA/cDNA使其去 除污染物。

4、设计引物和探针：设计特异性引物和荧光探针，进行目标序列特异性结合。

5、准备反应体系：按照说明书要求，配制引物、探针、模板、聚合酶、缓冲液等。

6、执行PCR 循环：将反应体系装入热循环仪并进行PCR 循环。检测DNA变性、引物结合、扩增和荧光信号等。

7、数据分析：根据荧光信号的变化，分析Ct值，计算目标序列的相对数量。




qPCR相关问题判断方法讲解
一、引物设计问题判断：

扩增：
1、扩增曲线从起始位置至结束，呈现S形状，表示正确。

2、扩增曲线不在起始位置且呈现递增向上曲线，表示错误。

曲线：
1、曲线峰值在Tm位置且只 有一个峰，表示正确。

2、多个峰或峰距离Tm值较远，表示错误。

仪器：
1、将qPCR产物采用琼脂电泳，条带在80-250bp附近，表示引物设计正确。

二、RNA提取合格判断：

紫外风光光度法：
1、峰值OD260/OD280小于1.8，表示蛋白质或酚类物质受到污染。

2、峰值OD260/OD280大于2，表示RNA提取中有机化合物和盐离子受到污染。

电泳法：
1、跑胶后在紫外灯照射下，出现5s、18s、28s三条清晰的条带，表示合格。

2、28s较暗或者条带拖尾不清晰，可能是RNA发生了降解，表示不合格。

三、RNA提取含量判断：
1、细胞是否充分裂解：把培养板密封，使用显微镜观察细胞情况是否符合实验要求。正常情况下细胞不呈现完整的形态。

2、细胞量是满足要求：正常情况下一个孔为一个样本，细胞体积如果较大，可以使用平皿。

3、试剂比例是否正确：按照说明书要求，增加或减少正确的试剂用量。

4、试剂混匀：异丙醇需要混匀，否则异丙醇会出现分层现象导致浓度不正确，RNA沉淀不了。

5、标记：RNA晾干后会变成透明，需根据沉淀位置，标记位置。

6、溶解：加入10μL的DEPC水进行溶解，随后检测浓度在稀释，防止RNA太稀导致实验无法进行。

四、结果差异不显示
RNA模版的总量应控制在10pg-1μg之间，如果RNA总量过大，不呈现差异的现象，或者干扰组的mRNA比对照组高。



qPCR常见问题解答“重复性”“曲线”
一、重复性差
仪器设备：移液器和定量仪器不准确，需要校准。
混匀：qPCR预混液需要混匀。

二、多个熔解曲线
非特异性扩增：
1、重新设计引物。
2、采用梯度法优化 PCR 对引物退火的温度。

引物二聚体：
1、采用琼脂糖凝胶电泳确认是否有引物二聚体。
2、设置Tm，多次比较好，选择适合的Tm值。
3、降低引物浓度。

污染：重新制备cDNA模板。

三、Ct值过晚出现
1、PCR引物过长，一般80-200bp之间即可。
2、cDNA模板降解，需要更换模版。
3、采用三步法扩增提高扩增率，第 一步加热变性（DNA90℃-96℃）、第二步退火（60℃-65℃）、第三步延伸（70℃-75℃）。
4、重新设计引物。
5、减少稀释度重复实验，防 止cDNA模板浓度过低。

四、Ct值内参gene正常，出现较晚
表达量较低：RNA发生降解，需重新富集。
扩增效率低：
1、重新设计引物。
2、降低退火温度

五、扩增曲线“S”型
扩增效率过高：
1、去 除模板浓度高的反应孔，重新分析标准曲线。
2、标准曲线采用克隆该基因的质粒做梯度稀释。
3、PCR 产物做梯度稀释，随后做定量扩增，利用曲线进行反应效率的评估。
4、纯化模板，去 除抑 制物。
5、延长干燥时间，以去除乙醇沉淀过程中的乙醇。
6、纯化柱中加入洗涤液将盐去 除。

扩增效率过低：
1、引物对Tm差异超过5°C。
2、热循 环条件不符合要求。
3、同源物质的竞争可造成反应效率低。

扩增曲线异常：扩增反应之前排查反应管中是否存有气泡残留。
扩增曲线呈锯齿状且不连续：校正参比染料。

六、标准曲线线性关系不佳
1、增加模板稀释倍数，提高加样体积。
2、样品发生降解，需重新制备。
3、增加模板稀释倍数，降低模版浓度。




qPCR数据结果差异分析
一、计算公式
差异倍数=2^-△△Ct
计算公式：△△Ct=△Ct（实验组）-△Ct（对照组）
△Ct（实验组）= Ct（实验组目的基因）- Ct（实验组内参基因）
△Ct（对照组）= Ct（对照组目的基因）- Ct（对照组内参基因）
△△Ct>0，目的基因下调，△△Ct<0，目的基因上调

二、检测方法
正态分布-方差齐：
1、两组数据:T-test方法(正态分布p＞=0.05、非正态分布p＜0.05)(方差齐p＞=0.05、方差不齐p＜0.05)
2、多组数据:ANOVA方法，总体均数不相等（Tukey HSD法、SNK法）






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