Western Blotting（WB）升级指南：内参基因的选择

千姿百态

蛋白质印迹（Western blot，WB）是一种已经实践了三十多年的技术，最初是作为检测复杂样品中靶标蛋白质的一种手段，科研工作中多用于研究基因表达水平，或蛋白与蛋白间的相互作用。再进行WB实验时，除了掌握必要的实验技巧外，还需要选择好内参基因，即在大多数情况下表达都相对稳定的基因，以这个基因作为“标尺”，衡量我们的靶基因的表达情况。
在日常实验设计时，我们想要明确我们研究的靶基因在设定的特定条件下的表达情况，必须引入内参基因，通过选择合适的内参基因，对比试验组和对照组中靶基因与内参基因表达量的相对差异，确认我们研究的的意义。
但大量研究表明，许多常用的内参基因在不同组织细胞、不同实验条件、不同生理状态下表达水平有较大差异，迄今尚未发现普遍适用于所有条件的内参基因[1]。因此，在特定样本集合中选择恰当的内参基因至关重要。
本文将从内参基因的定义、特点、作用、常用的内参基因及如何选择等方面进行介绍，希望可以为大家的科研项目研究提供帮助。
内参基因是什么
01内参基因在各细胞和组织中的表达量比较恒定，在评价基因的表达水平变化时常用它们来做参照物，内参基因指在不同处理因素作用下均不会发生表达量改变的基因。最常见的内参基因是内源性参照基因，也叫管家基因。
管家基因：又称持家基因(house-keeping genes)，生物体各类细胞中都表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。管家基因是为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的基因。管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。管家基因高度保守并且在大多数情况下持续表达。
内参基因特点
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理想的内参基因应具备以下特点：
① 稳定性：在各组织细胞中表达相对稳定，无显著差别；且不受实验处理的影响。
② 普遍性：在各组织细胞中广泛存在，方便用于蛋白测试。
③ 易检测性：表达丰度较高，且与目的基因的表达量具有可比性，易于检测；
④ 不易受干扰：表达水平不受任何内源性或外源性因素的影响。
内参基因作用
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① 标准化蛋白样品上样量。内参蛋白是细胞中稳定表达且量相对恒定的蛋白质。通过对比每个样品孔的内参蛋白量，可直观评价每个样品中蛋白质上样量是否一致，保证了实验数据的可靠性。
② 矫正实验误差。在Western Blot实验过程中，从样品制备、蛋白质提取、蛋白电泳到转膜、抗体孵育等多个步骤中均可能引入技术误差。内参蛋白可以用来指示这些操作步骤中可能出现的误差情况，确保实验数据的科学性。
③ 蛋白的相对定量分析。在做Western Blot实验结果分析时，通常会将目的蛋白的信号强度和内参蛋白的信号强度的比值来评价目的蛋白的相对表达量。这种比值计算方法能够排除因实验条件、实验处理等带来误差因素的影响，更准确地反映目的蛋白在不同样品中的相对表达水平。
有哪些常用的内参基因？
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目前在实验中比较常用的内参基因主要为GAPDH（36KDa）、β-actin（42KDa）、β-tubulin（50-55KDa）等，详细如表1所示。

样本类型	内参蛋白基因	分子量（kDa）	使用场景
细胞总蛋白和胞浆	GAPDH	37	不宜作为糖代谢紊乱和缺氧的状态下的样本的内参
HSP 60	60
Vinculin	124	大分子量蛋白可参考
β-Tubulin	55	可能不适合于研究对象之间年龄差异大的情况，微管蛋白的表达随着抗菌和抗有丝分裂抗性药物而改变，因此在加入抗癌和抗真菌药物时不宜作为样本的内参。
α-Tubulin	55
β-Actin	43	不适用于细胞核提取物，因为β-actin是染色质重塑复合物中的组分;可能不适合于研究对象之间年龄差异大的情况
Cofilin	19
Profilin 1	5/9
核蛋白	组蛋白H3（Histone H3）	17
增殖细胞核抗原（PCNA）	36	不宜作为非增殖细胞的内参等
TBP	38	不适合凋亡实验以及去除DNA的样本
YY1	65-70
Lamin B1	67	不宜用来做凋亡实验的内参；不宜作为胚胎干细胞的内参。不适于去除核膜的样本
HDAC 1	62
Lamin A/C	63/74
PARP	89/116
质膜	Caveolin-1	21/24
CD71	85
Na/K-ATPase α亚基	112
Na/K-ATPase β亚基	33
Cadherin	135
线粒体	COX IV	16
VDAC/Porin	34
HSP 60	60
肌肉样本	SDHA	62-73
血清和外细胞液	转铁蛋白（transferrin）	77	对于分泌性样本，如血浆、乳汁等，由于没有完整的细胞结构，应选择分泌蛋白作为内参
Albumin	66	含量极高，注意降低WB实验上样

如何选择最佳的内参基因？
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正确的选择内参基因，很大程度上依赖所研究的细胞或组织，不同的试验需要寻找适合各自试验体系的特异性稳定表达的内参基因。然而，合适内参基因的选择，需要在各种类型的细胞或组织和各种试验条件下进行比较选择。
具体应该如何从项目的源来来选择内参基因呢？
① 确认靶蛋白后，先通过权威的蛋白质数据库Uniprot（https://www.uniprot.org/）查找靶蛋白信息，关注蛋白的细胞亚定位（确定选择提取细胞的总蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、核蛋白还是细胞器蛋白）和分子量（区分内参蛋白的分子量）。
② 根据查到的信息，确定要提取的蛋白类型（总、膜、胞质、核还是细胞器），按表1建议选择内参，需要注意的是，某些病理生理状态下，有些管家基因的表达会受到明显干扰。
③ 选择与待测蛋白在生物学功能上无关的蛋白作为内参。
④ 内参的分子量与目标蛋白质不同，易于区分。一般建议分子量相差5KDa以上。
⑤ 选择与样本蛋白定位一致，或包含与样本蛋白的样品。如选用TBP作为内参，需要样本还有DNA。

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