Mol Cell | 为何PAM放宽的基因编辑工具大多"效率感人"？Jennifer Doudna等在Cell子刊揭示原因！

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2025年4月23日，Molecular Cell发表了一项来自Jennifer A. Doudna和Zev Bryant团队的重要研究成果：‘Rapid two-step target capture ensures efficient CRISPR-Cas9-guided genome editing’，该研究揭示了CRISPR-Cas9基因编辑系统中一个关键的矛盾：为何PAM识别范围更广的Cas9变体，往往编辑效率却显著降低？


PAM放宽变体：扩展靶点但效率打折
CRISPR-Cas9基因编辑系统工作时需要识别DNA序列中的PAM位点。传统的SpyCas9只能识别NGG序列，限制了其靶向范围。为了扩大可编辑范围，研究人员开发了PAM放宽的变体，如SpG(识别NG)和SpRY(识别NR，R=A或G)。
然而，实验证明这些PAM放宽变体的编辑效率显著降低。在HEK293T细胞中，SpG和SpRY的DNA切割速度比野生型SpyCas9慢2-4倍，而在RNP核转染后72小时，其引入的基因组编辑(indels)仅为野生型的1/10左右。（图1）



图1 PAM放宽变体的编辑效率对比

Cas-sgRNA复合体识别目标分子机制：两步靶点捕获过程出了问题
为何PAM放宽变体效率低下？研究团队通过生化实验、单分子追踪和细胞实验揭示了其中的分子机制。
研究发现，Cas9识别靶序列是一个"两步捕获"过程：（图1 A）

• 初始PAM结合；
  
  
• DNA解链并形成R-loop结构。
  

“动力学陷阱”：PAM-relaxed变体的阿喀琉斯之踵
通过精密的单分子实验（AuRBT技术），研究人员发现，相比WT Cas9，像dSpRY（SpRY的失活版本）这样的PAM-relaxed变体在第一步（初始结合）上表现得非常不同。   
WT Cas9：它与PAM的结合虽然是特异性的，但亲和力相对较低（结合得不那么“死”），能够快速地从结合状态进入第二步（DNA解旋）;  
SpRY：它与DNA的初始结合反而更强、更持久，而且不怎么挑剔PAM序列。但这却成了一个“动力学陷阱”（Kinetic trap）。SpRY一旦结合到DNA上（即使是非目标位点），就很难快速启动第二步的DNA解旋过程，因为它被“卡”在了初始结合状态。（图2）



图2

强大而泛滥的非特异性结合
更关键的是，PAM放宽变体对各类DNA序列展现出更强的非特异性结合能力。SpRY表现出持续的非特异性DNA结合，甚至导致轻微的DNA解链，而野生型SpyCas9仅在识别NGG PAM时才有短暂的特异性结合。
在竞争性DNA存在的情况下，PAM放宽变体的效率问题更为严重。当加入403倍过量的质粒DNA竞争物时，SpRY的切割速率减慢了约200倍，而野生型SpyCas9仅减慢了3.5倍(图3)。



图3

试图提高效率：降低解链能量门槛仍不够
研究团队尝试通过引入错配泡(mismatch bubble)来降低目标DNA解链的能量门槛。虽然这确实提高了SpRY的切割速率和产物产量（图4 A），但在竞争条件下其效率仍然远低于野生型SpyCas9。
电泳迁移率实验(EMSA)进一步证实，即使使用错配泡，SpRY在过量三文鱼精DNA存在时仍完全无法结合靶DNA(图4 B)。这表明强烈的非特异性结合仍是主要障碍。



图4

这项研究揭示了一个基因编辑中的根本权衡关系：PAM特异性与编辑效率之间存在本质矛盾。
高效的CRISPR-Cas9编辑依赖于优化的两步靶点捕获过程：特异性但低亲和力的PAM结合；随后快速的DNA解链。
这项研究告诉我们，在追求更广泛靶向范围的同时，不能忽视PAM识别特异性与亲和力之间的微妙权衡。未来的基因编辑器开发，可能需要更关注优化从初始结合到DNA解旋的过渡态动力学，而不仅仅是改变PAM识别本身。理解这种内在的平衡机制，对于设计更安全、更高效的基因编辑工具至关重要！
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