流式细胞技术方法介绍

风云

来源:生物制品质量分析

背景了解

流式细胞仪是一种用于对细胞或其他生物微粒进行多参数、快速定量分析和分选的高科技仪器，是实现流式细胞术的关键设备。能够对细胞进行自动分析和分选，可快速检测液体中的分散细胞的一些参数，根据预选的范围将指定的细胞亚群分选出来。流式细胞仪在细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血液学、微生物学等多个领域都有广泛应用。

图1.流式细胞仪简图（来源于：什么是流式细胞仪？了解流式细胞仪检测原理、组成结构）
流式细胞仪的检测原理

将待测细胞或生物微粒被制备成单细胞悬液，在鞘液的包裹下，排成单列依次通过检测区域。当细胞通过高强度激光束时，会产生光散射现象，其中前向散射光（FSC）的强度与细胞大小相关，侧向散射光（SSC）的强度反映细胞内部结构的复杂程度，如细胞核形状、细胞质内颗粒的多少等。与此同时，若细胞被荧光物质标记，在激发光下，荧光物质会发射出特定波长的荧光，不同荧光颜色和强度对应细胞的不同特性。通过对散射光和荧光信号的检测与分析，就能得到细胞多方面的数据。


图2.流式细胞仪检测原理（来源于：一文了解流式细胞术）
流式细胞仪的结构组成

流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统和分选系统四大部分组成，以下是具体介绍：
01
液流系统

流动室：是细胞或微粒进行检测的核心部位，鞘液和样本流在其中交汇，使样本中的细胞或微粒在鞘液包裹下形成单细胞流通过检测区域。
鞘液池：储存鞘液，为液流系统提供稳定的鞘液供应，保证鞘液能够持续、均匀地包裹样本流。
液流驱动装置：通常由压力泵或蠕动泵等组成，通过施加压力或蠕动作用，推动鞘液和样本流在流动室内流动，确保细胞或微粒以稳定的速度和状态通过检测区域。

02
光学系统

激光光源：为细胞或微粒的检测提供激发光，具有高亮度、高单色性和高方向性等特点，能使细胞上的荧光物质被有效激发产生荧光信号。
光学透镜组：包括各种透镜和反射镜，用于聚焦和校准激光束，使其精确地照射到流动室中的细胞或微粒上，并收集细胞或微粒产生的散射光和荧光信号，将其引导至光电探测器。
滤光片：可将不同波长的光进行分离，只允许特定波长的散射光或荧光通过，确保光电探测器接收到的信号准确、纯净，提高检测的特异性和准确性。
光电探测器：常用的有光电倍增管（PMT）和雪崩光电二极管（APD）等，能将接收到的散射光和荧光信号转换为电信号，以便后面的电子系统进行处理。

03
电子系统

信号放大器：将光电探测器输出的微弱电信号进行放大，使其达到可被计算机系统识别和处理的强度水平，通常有线性放大器和对数放大器两种类型，可根据信号的特点和检测需求进行选择。
模数转换器：将放大后的模拟电信号转换为数字信号，便于计算机进行存储、分析和处理，保证数据的准确性和可靠性。
计算机控制系统：是流式细胞仪的“大脑”，负责控制仪器的各种运行参数，如激光功率、液流速度、检测时间等，同时对采集到的数据进行分析处理和显示，还可实现数据的存储和管理。

04
分选系统

充电电路：在细胞或微粒通过检测区域时，根据其检测参数和设定的分选标准，对目标细胞或微粒进行充电，使其带上正电荷或负电荷。
偏转板：位于流动室下方，当带电的细胞或微粒通过偏转板时，在电场的作用下发生偏转，从而使目标细胞或微粒与其他细胞或微粒分离，实现分选目的。
收集装置：用于收集分选后的细胞或微粒，通常由不同的收集管或容器组成，可根据需要对不同类型的细胞或微粒进行分别收集，以便后续的实验研究。


图3.流式细胞仪的结构组成

流式细胞仪的检测样品

01
细胞类

血液细胞：如外周血中的淋巴细胞、粒细胞、红细胞、血小板等，可用于白血病诊断、淋巴细胞亚群分析、贫血类型判断等。
骨髓细胞：用于白血病、骨髓增生异常综合征等血液系统疾病的诊断、分型及治疗监测，还可对骨髓造血干细胞进行分析和分选。
组织来源的细胞：从实体组织如肿瘤组织、肝脏、肾脏等通过酶消化、机械解离等方法获得的单细胞悬液，可用于肿瘤细胞的生物学特性研究、免疫细胞浸润分析等。
培养细胞：各种细胞系及原代培养细胞，常用于细胞生物学研究，如细胞周期、细胞凋亡、细胞信号转导等方面的检测。

02
微生物类

细菌：可对细菌的大小、形态、表面抗原、核酸含量等进行分析，用于细菌的分类鉴定、耐药性检测等。
真菌：如对酵母菌、霉菌等真菌细胞进行检测，分析其细胞结构、生理状态、药物敏感性等。

03
其他生物微粒

外泌体：细胞分泌的纳米级囊泡，包含蛋白质、核酸等生物分子，通过流式细胞仪可检测外泌体的大小、数量、表面标志物等，用于疾病诊断、治疗监测及细胞间传递等。
微球：人工合成的具有特定大小、表面性质和荧光标记的微球，常用于免疫检测、细胞分选、药物递送等研究，可作为标准品或载体进行相关实验。

流式细胞仪的实验步骤

01
样本制备

单细胞悬液制备：组织样本需用机械方式进行解离，再用胰蛋白酶等消化液处理，经滤网过滤得到单细胞悬液。血液样本可直接离心获取细胞沉淀，加入红细胞裂解液去除红细胞后得到白细胞悬液。细胞培养样本则用胰酶消化后收集细胞。
细胞计数与活力检测：采用台盼蓝染色法或细胞计数仪对细胞进行计数和活力检测，确保细胞活力在90%以上。
细胞固定与破膜：若检测细胞内抗原，需用多聚甲醛等固定液固定细胞，再用皂素等破膜剂进行破膜处理。

02
染色标记

表面抗原染色：向细胞悬液中加入适量荧光标记的抗体，充分混匀，在4℃或室温下避光孵育一定时间，一般为30分钟左右。
细胞内抗原染色：在固定破膜后的细胞悬液中加入针对细胞内抗原的荧光标记抗体，孵育条件与表面抗原染色类似。
核酸染色：对于细胞周期、凋亡等检测，需用碘化丙啶（PI）、7-AAD等核酸染料对细胞进行染色，一般在染色缓冲液中孵育15-30分钟。

03
上机检测

仪器校准：使用标准微球对仪器的光路、液流等进行校准，确保仪器处于最佳工作状态。
参数设置：根据实验目的和样本类型，设置检测参数，如激光功率、光电倍增管电压、增益、补偿等。
样本检测：将染色后的样本放入流式细胞仪进样器，启动仪器进行检测，采集细胞的散射光和荧光信号数据。
数据分析：将检测得到的数据保存为标准格式文件，以便后续分析。利用FlowJo、CellQuest等专业分析软件，根据细胞的散射光和荧光特性，通过设门、绘制直方图、散点图等方法，对目标细胞群体进行分析，计算阳性细胞比例、平均荧光强度等指标。

流式细胞仪的注意事项

01
样本方面

样本新鲜度：尽可能使用新鲜采集的样本，血液、组织等样本采集后应尽快处理，避免细胞活性下降、抗原表达改变或细胞发生凋亡、坏死等。
细胞悬液质量：确保细胞悬液均匀，无细胞团块。可通过滤网过滤细胞悬液，以保证细胞能够单个通过检测通道，防止堵塞仪器。
避免交叉污染：处理不同样本时，要更换移液器枪头、离心管等耗材，防止样本间交叉污染影响检测结果。

02
试剂方面

抗体选择与保存：根据实验目的和样本类型选择合适的荧光标记抗体，注意抗体的特异性、亲和力等参数。抗体应按照说明书要求的条件保存，避免反复冻融。
染色条件优化：严格按照试剂说明书进行染色操作，包括抗体浓度、染色时间、温度等条件。对于新的抗体或样本类型，需进行预实验优化染色条件。
试剂质量控制：定期检查试剂的质量，如荧光染料是否降解、抗体是否失效等，使用前观察试剂有无变色、沉淀等异常现象。

03
仪器方面

仪器校准与维护：定期对仪器进行校准和维护，包括光路校准、液流系统检查等，确保仪器处于最佳工作状态。
仪器参数设置：根据样本和检测目的合理设置仪器参数，如激光功率、电压、增益、补偿等，参数设置不当可能导致信号检测不准确或细胞分群不清晰。
防止仪器堵塞：避免将杂质、气泡等引入仪器，检测结束后，需用专用的清洗液对仪器进行冲洗，防止细胞碎片、残留试剂等堵塞管道。

04
其他方面

温湿度控制：仪器室的温度和湿度应保持稳定，一般温度控制在20-25℃，湿度在40%-60%，以保证仪器的正常运行和检测结果的稳定性。
数据分析方法：选择合适的数据分析软件和方法，对数据进行合理的设置、统计和分析，避免因分析方法不当导致结果误判。

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