代谢组学高分辨质谱检测——再现性问题

千姿百态

高分辨质谱代谢组学：再现性挑战与优化策略

高分辨质谱是代谢组学和蛋白组学研究的核心工具，但在大批量样本分析中，再现性（Reproducibility）问题常成为科研人员面临的巨大挑战。
本文将深入剖析使用Orbitrap、QTOF等高分辨质谱仪进行代谢组学分析时常见的再现性问题及技术原因，并针对实验设计、进样顺序、仪器状态维护、数据预处理等方面提出优化策略，以提升分析结果的一致性。

01 再现性挑战：高通量代谢组学中的难题




图1：代谢组学分析中的变异来源。代谢组学数据的总变异可分为生物学变异和技术变异。技术变异又包括前处理变异（样本采集、准备和保存过程差异）和分析测定变异（如质谱保留时间漂移、信号强度漂移等）。这些技术因素若未加以控制，会导致不同批次或不同时间点测试结果不一致，使得再现性下降。

在高分辨质谱的非靶向代谢组学研究中，由于一次实验通常涉及数百上千个代谢物信号，任何细微的仪器波动或操作差异都会被放大。例如：质谱仪在长时间运行中可能出现保留时间漂移或灵敏度变化；进样针残留导致样品串扰；质谱离子源污染累积使得响应逐渐降低。这些因素会造成相同样品重复分析时峰强度、峰面积的不一致，带来较高的相对标准偏差（RSD）。数据重复性差会直接影响统计分析和生物学结论的可靠性。
质谱再现性的重要性：对科研人员而言，可重复的数据意味着实验结果可信、结论稳健。因此，国际上对代谢组学研究的质控要求日趋严格。相关指南指出，实施严格的质量控制策略对确保代谢组学数据的再现性、准确性和有意义性至关重要。因此，在开展代谢组学实验时，我们需要充分认识再现性问题的来源并采取有效措施加以克服。

02 常见原因剖析：影响再现性的技术因素




图2：质谱样品前处理示意。上图展示质谱分析前科学家对生物样本进行处理和分配的过程。样本在制备阶段可能因人员操作差异、试剂批次不同、处理时间长短等引入前处理变异。严格规范的标准操作流程（SOP）和内标控制有助于降低这一阶段的误差。

1.样本前处理与实验设计
前处理过程的微小差异都会影响代谢物检测值的稳定性。例如，不同实验人员的提取手法、溶剂纯度差异，或样本存储条件（温度、时间）不同，都会改变代谢物谱图。此外，实验设计中如果样本排列顺序欠合理（例如将不同组别样本集中进样，而非随机混合），可能将系统误差混淆为生物学差异。
解决方法：尽量统一和标准化样本处理流程；采用随机进样顺序或区组设计，使批次效应均匀分布在各比较组中；在每一批次样本分析前后加入平行处理的质控样本（如混合样本池）监测前处理和分析的一致性。
2.进样顺序与批次效应

质谱在长时间运行中性能可能逐渐变化，导致所谓批次效应。例如，第1天检测和第2天检测即使针对同一样本，结果可能存在系统偏差。常见现象包括保留时间逐渐推迟（色谱柱老化导致流速变化）和信号响应下降（离子源污染或灵敏度衰减）。如果不加控制，当我们对大量样本按固定顺序连续进样时，靠后的样本整体峰面积可能偏低，进而扭曲实际生物学差异。



图3：液相色谱-质谱自动进样器中待分析的样品瓶。在大规模项目中，常需数百上千个样品连续分析。

优化策略：在进样序列中每隔一定数量样本插入Pooled QC（混合质控样品）和/或重复样本。这些QC样品用于监测仪器信号随时间的漂移情况，可在数据分析时用于校正。图4展示了一种常用的序列设计：用字母P表示质控样本，S表示真实样本，通过交替插入质控样本来校正批次效应。


（图4：进样序列设计及批次效应校正示意。上方 (A)：进样队列示例，P为质控样本（Periodic QC），S为真实样本。定期插入的质控样本用于计算批次校正因子。下方 (B)：批次效应导致的信号随时间下降曲线（蓝点），以及基于质控的校正曲线（红线）。通过质控样本信号拟合出漂移曲线，对真实样本进行修正，可显著提高不同批次间的数据一致性。质控频率越高，校正越准确。）
3.仪器状态与性能波动

高分辨率质谱仪（如Orbitrap、Q-TOF等）本身的性能稳定性对再现性至关重要。仪器长时间运行后可能出现质量轴偏移（mass drift）或分辨率变化，需要定期校准。此外，离子源、毛细管等部件可能逐渐污染，影响电离效率。
优化措施：制定严格的仪器维护计划，包括定期调谐校准、清洁离子源和更换色谱柱等。在每次批次分析前确保仪器处于稳定状态，如先运行一定数量的平衡样本或空白以“热机”，避免初始数据漂移。
4. 数据采集和分析方法因素

不同的软件参数（例如峰提取算法、峰面积积分方式）也会造成结果差异。如果峰检测阈值设置不当，重复分析时有些弱信号峰可能有一次被检出、另一次漏检，导致数据缺失的不一致。
应对方法：对于非靶标代谢组学，通常使用同一套软件和参数对所有批次样本统一进行峰提取、对齐和定量，避免人为调整。同时应用针对批次效应的校正算法（如LOESS校正、Spline校正等）处理数据，以消除因仪器信号波动带来的系统偏差。


（图5：批次效应校正前后数据主成分分析（PCA）比较。左侧Raw为未校正数据，不同批次的质控样本（蓝、橙、绿点）在PCA图上明显分离（黑色虚线椭圆圈出）；右侧几种校正方法（Median中位数校正、QC-RSC质控样条校正、TIGER算法校正）处理后，质控点在PCA空间高度重叠，批次间差异显著减少，体现出数据再现性的提升。）
综上，仪器漂移、样本处理差异和数据处理不当是高分辨质谱代谢组学再现性不佳的主要技术原因。这些问题往往相互叠加，使得大规模研究中获取稳定一致的数据变得困难。但值得庆幸的是，通过有针对性的质控措施和方法优化，我们可以显著改善再现性。

03 提升再现性的策略与优化

​面对上述挑战，科研工作者和质谱平台通常会在实验全过程引入一系列质控和优化手段，以确保数据可靠。以下是常用的策略：
1.严格的质控样本策略：

在样本序列中定期插入质控样本（QC）。质控样本可以是课题组自制的混合均一样本池，代表整个实验中平均的基质。通过监测质控样本的分析结果，可以评估仪器在整个分析过程中的稳定性。如果质控样本的RSD超过预设阈值（例如>30%），则提示该批次数据可靠性存疑，需要重新校正或剔除。此外，一些实验还加入系统适用性样本（System Suitability Sample）在分析前后检测，验证仪器性能是否达到要求。
2.内标和标准品校准：

在代谢组学中使用同位素内标是一种提升定量再现性的有效手段。将已知浓度的同位素标记代谢物加入每个样本中，可以校正样本间提取效率和离子化效率的差异。例如，针对不同类别代谢物选用多种稳定同位素内标，可以同时监控质谱信号漂移并进行归一化校正。这种方法已被证明可提高数据稳健性。另外，定期跑已知浓度的标准品，根据检测值计算回收率，也能评估分析过程的再现性。
3.数据预处理校正：

在得到原始数据后，充分利用统计和算法对数据进行批次效应校正和质量控制过滤。例如，应用质控样本驱动的曲线校正（如QC-RSC）和中位数归一化等方法，将不同批次的质控信号校正到同一水平，然后对真实样本进行相同校正。这类方法往往可以将代谢物峰面积的RSD显著降低（文献报道可降低超过50%以上）。同时，剔除那些在质控样本中RSD过高的特征峰，或在空白样本中出现的背景峰，只保留高质量特征用于下游生物学分析，以避免假阳性干扰。
4.专业培训与SOP规范：

提升再现性还依赖于实验人员的规范操作和经验积累。实验室应制定详细的标准操作流程（SOP），涵盖从样本采集、保存、前处理到仪器参数设置、质控方案等各环节，并对相关人员进行培训。这确保了不同人、不同时间进行相同实验时遵循一致的步骤，从源头上减少人为变异带来的不一致。
通过以上策略的综合应用，代谢组学实验的数据再现性将大幅提升。这不仅赋予实验结果更高的可信度，也使科研人员对微小的生物学差异更有信心。

04 优米质谱助力高再现性代谢组学研究

面对再现性挑战，优米质谱依托自身强大的技术平台和服务经验，能为科研客户提供了行之有效的解决方案：



优米质谱高端质谱平台



优米质谱高端质谱平台

优米质谱配备了价值千万级的多型号高端质谱仪器阵列，包括高分辨质谱（HR-MS）、液相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS）等，可根据课题需求灵活选用最佳分析平台。这些仪器均经过严格校准和性能验证，确保提供高灵敏度和高准确度的数据。
在项目执行过程中，优米质谱建立了完善的质量控制体系：从样本接收、前处理到上机检测，每批次均设立质控样本监测指标，确保分析过程的稳定可控。依托丰富的经验，工程师团队能够及时发现并排除仪器异常，例如在质控指标轻微波动时立即进行维护清洁，避免问题积累影响后续样本。
在数据处理阶段，优米质谱配备专业的生物信息和统计人员，使用国际主流的软件和自有开发的流程对数据进行严谨分析。对于非靶向代谢组学数据，会采用如基于质控样本的批次校正等方法和人工检查相结合的方式，最大程度保证数据的可靠和一致。同时，通过内部建立的代谢物标准库和背景噪声谱库，过滤可能的假阳性峰，确保报告给客户的差异代谢物经得起重复验证。

05 结语

再现性是代谢组学研究能否取得可靠结论的基石。在高分辨质谱分析中，科研人员需要从实验设计伊始就将再现性控制贯穿全过程，通过严格的质控和优化策略，将技术变异降至最低。当挑战被逐一克服，数据变得高度一致，我们才能对微妙的代谢变化充满信心地加以解释，这对于疾病机理研究、新型生物标志物发现等都有非凡意义。
优米质谱期待与广大科研工作者合作，凭借先进的平台和丰富的经验，为您的课题保驾护航，在代谢组学和蛋白组学领域取得突破性进展。让我们共同努力，提升数据再现性，将组学研究推向更高水准！

优米质谱

优米质谱配备千万级别的多型号高端质谱仪，可承接代谢组与蛋白质组等课题研究，在检测、组成分析和组学研究等方面具有丰富经验和技术优势，能够根据不同研究需求提供一站式的解决方案，欢迎合作。
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