PCR专题(Ⅰ): 带你认识基础PCR实验【i实验】

HaHa

『i实验』是i科研公众号于2019年末推出的一档全新的专栏，专栏旨在为实验小白们介绍经典实验的原理和操作方法，分享实验资料，解析实验技巧。新的一年，『i实验』将继续分享科研实验方面的内容，不断改进，与各位小伙伴们一同成长。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ,PCR）是一种用于扩增特定的DNA片段的技术，PCR技术能够实现短时间内微量DNA分子的大量扩增。PCR技术是现代分子克隆技术的基石，更是一种必不可少的技术。『i实验』将于近期推出PCR技术专题，带领小伙伴们更加深入的了解PCR技术。




PCR技术由美国Cetus公司的科学家Mullis发明，Mullis也因该项成就获得了1993年的诺贝尔化学奖。1989年，Science将PCR技术评为当年的十大科学发明之首，并将热稳定的DNA聚合酶评为“年度分子”。
随着DNA分子结构的发现，60年代末期，科学家们开始研究基因的体外分离技术。早在1971年，科学家Korana就曾提出核酸体外扩增的设想。美籍印裔科学家哈尔·葛宾·科拉纳 (Har Gobind Khorana)破译遗传密码，首次完成丙氨酸tRNA编码基因的完成。体外扩增DNA的需求变得越来越大。
Mullis最初使用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。Klenow片段不耐高温，这就导致PCR每次循环都要重新加。另外，引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，这就导致了合成的DNA片段不均一。幸运的是，1986年， Cetus公司在原有基础上优化了PCR的条件，在Mullis的建议下使用了由Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。1987年，PerkinElmer推出了热循环仪，该仪器可调节反应温度，并根据需要加热或冷却样品。这些优化极大提高了扩增片段特异性和扩增效率，也促进了PCR技术的的广泛推广。
PCR技术由美国Cetus公司的科学家Mullis发明，Mullis也因该项成就获得了1993年的诺贝尔化学奖。1989年，Science将PCR技术评为当年的十大科学发明之首，并将热稳定的DNA聚合酶评为“年度分子”。
随着DNA分子结构的发现，60年代末期，科学家们开始研究基因的体外分离技术。早在1971年，科学家Korana就曾提出核酸体外扩增的设想。美籍印裔科学家哈尔·葛宾·科拉纳 (Har Gobind Khorana)破译遗传密码，首次完成丙氨酸tRNA编码基因的完成。体外扩增DNA的需求变得越来越大。
Mullis最初使用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。Klenow片段不耐高温，这就导致PCR每次循环都要重新加。另外，引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，这就导致了合成的DNA片段不均一。幸运的是，1986年， Cetus公司在原有基础上优化了PCR的条件，在Mullis的建议下使用了由Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。1987年，PerkinElmer推出了热循环仪，该仪器可调节反应温度，并根据需要加热或冷却样品。这些优化极大提高了扩增片段特异性和扩增效率，也促进了PCR技术的的广泛推广。


▼DNA的半保留复制

DNA复制过程
https://www.zhihu.com/video/1216816484745687040
总的来说，复制过程分为3个阶段，即复制的起始、复制的延伸及复制的终止。复制的过程以半保留、半不连续的方式进行。

• DNA复制时，总是从某一特定区域开始，这个区域成为复制起点（ori），通常来说，原核生物DNA上的起始位点较少，而真核生物DNA上具有多个起始位点（人体细胞内DNA喊你有10万个复制起点）。DNA复制时，只有局部区域的双链会打开，形成复制单位，即复制子（replicon）。
  
• 由于DNA聚合酶只能催化从5’ → 3’的反应，因此，只有一条DNA链可以连续合成子代DNA，该条DNA称为先导链。合成先导链时，首先由引物酶在模板链的3’端合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶在其3’端加上dNTP。另一条以不连续的方式进行合成的DNA成为后随链，后随链上会形成多个引物，每个引物后会形成几百个脱氧核糖核苷酸的DNA片段，也称为冈崎片段。
  
• 当复制叉移动到复制终点时，复制停止。
  

▼PCR的技术原理


https://www.zhihu.com/video/1216817078025695232

• PCR也分为三个阶段：高温变性、退火和延伸。
  
• 在高温条件下（94℃-98℃），DNA的双链变性（denaturation）会解离成单链；适当地降低反应体系的温度（50℃-60℃）后，反应体系中的引物便可与游离的单链模板相结合，这个过程称为退火（annealing），也称为复性。在72℃左右的条件下，由热稳定的DNA聚合酶催化延伸(elongation)过程，即在3’-羟基末端加入dNTP。
  

• 循环以上过程可使DNA的扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y即为DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。
  

• 反应初期，靶序列DNA片段呈指数增长，随着反应的进行，被扩增的DNA片段逐渐进入线性增长期或静止期，即出现平台效应
  

体内DNA复制过程与PCR的区别




目前，PCR技术已经广泛应用在基因克隆/探针制备（原位杂交）、基因表达水平、基因突变的检测（检测插入、缺失等信息）、基因定位（分子标记）等实验中，广泛应用于法医检测、诊断试剂开发等领域。
目前，PCR技术以衍生出多种变体，常见的PCR类型包括反向PCR、不对称PCR、荧光定量PCR、逆转录PCR、RACE-PCR、巢氏PCR、降落PCR等。『i实验』也将于近期推出这些技术的讲解推送，敬请小伙伴们关注。
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