一文掌握茜素红染色实验

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实验原理 茜素红（Alizarin Red）是一种蒽醌类染料，其分子中的羟基和羰基可与钙离子（Ca²⁺）特异性结合，形成稳定的橙红色复合物。染色结果的深浅直接反映钙盐沉积量，且在pH 4.2的酸性环境下结合力最强。通过调节染色液的pH值，还可区分磷酸钙（pH 4.2）和草酸钙（pH 6.8）等不同钙盐类型。 试剂准备 1. 茜素红染液：称取2g茜素红S粉末，溶于100ml蒸馏水，加入1ml冰醋酸调节pH至4.2（用pH计校准），过滤后避光保存（有效期3个月）。 2. 分化液：0.1%盐酸乙醇（70%乙醇99ml + 浓盐酸1ml），现用现配。 3. 核固绿复染液：0.1%固绿FCF溶于0.1%醋酸溶液，过滤后4℃保存。 4. 封片介质：推荐中性树脂封片剂（如Entellan），避免水性介质溶解染料。 关键细节：茜素红染液需用棕色瓶避光保存，防止氧化失效；盐酸乙醇分化液需密封防止挥发导至浓度变化。 操作步骤 1. 脱蜡与复水 石蜡切片依次浸入二甲苯Ⅰ（10分钟）→二甲苯Ⅱ（10分钟）→无水乙醇Ⅰ（5分钟）→无水乙醇Ⅱ（5分钟）→95%乙醇（3分钟）→80%乙醇（3分钟）→蒸馏水浸洗2分钟。若脱蜡不彻底，切片表面会残留蜡膜，染色后呈斑驳状，可用苏丹黑预染验证。
2. 茜素红染色 切片浸入茜素红染液，室温孵育3-5分钟（骨组织需延长至8分钟）。染色过程中避免震动染缸，防止染料沉淀附着。 3.分化去背景 快速浸入0.1%盐酸乙醇分化5-10秒，立即流水冲洗3分钟。分化是核心步骤——分化不足时背景呈粉红色，过度分化则钙信号丢失。新手建议每2秒镜下观察一次，至间质背景无色、钙盐沉积呈橙红色即可。 4. 核固绿复染 切片浸入核固绿染液1分钟，流水冲洗1分钟。复染时间过长会掩盖钙信号，建议细胞核呈淡绿色为宜。 5. 脱水与透明 梯度乙醇脱水（80%→95%→100%乙醇各1分钟）→二甲苯透明（2次×2分钟）。脱水不彻底会导至封片后切片浑浊，透明时间不足则出现云雾状结晶。 6. 封片观察 滴加中性树脂封片剂，加盖玻片轻压排除气泡。普通光镜下钙盐沉积呈橙红色，细胞核淡绿色；偏振光下羟基磷灰石晶体呈现双折射现象。 常见问题与解决方案 问题1：全片深红无分化  原因：分化液浓度不足或时间过短。 解决：更换新配制的0.1%盐酸乙醇，分化时间延长至15秒。 问题2：钙信号微弱  原因：染色液pH值偏离或染色时间不足。 解决：用pH计校准染液至4.2，骨组织染色延长至10分钟。 问题3：背景绿色干扰  原因：核固绿残留过多。
解决：复染后流水冲洗延长至2分钟，或降低固绿浓度至0.05%。 问题4：切片龟裂  原因：脱水过快或封片剂过量。 解决：乙醇梯度每步延长至2分钟，封片时控制树脂用量（直径1cm圆滴）。 结果解读 •骨组织矿化：生长板钙化带呈致密橙红色，骨小梁边缘染色最深。 •肿瘤钙化：乳腺癌、甲状腺癌等钙化灶呈颗粒状或团块状橙红色沉积。 •血管钙化：动脉粥样硬化斑块内见点状或线状染色，偏振光下可见双折射结晶。 •假阳性陷阱：铁、铝等金属离子可能非特异结合，需结合普鲁士蓝染色排除干扰。 特殊样本处理方案 •冰冻切片：省略脱蜡步骤，水化后直接染色，但分化时间缩短至3秒（防止组织溶解）。 •含铁样本：染色前用3%盐酸浸泡10分钟去除铁离子干扰，再流水冲洗30分钟。 •双重染色：茜素红染色后联合Van Gieson染色，可同步观察钙盐与胶原纤维分布。