一文掌握刚果红染色实验

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实验原理 刚果红是一种联苯胺衍生物，其分子中的氨基和羟基可与淀粉样蛋白的β-折叠结构特异性结合，形成平行排列的复合物。这种有序排列使得染色后的淀粉样物质在偏振光下呈现独特的苹果绿双折射，而普通胶原纤维仅显暗红色。刚果红的染色特异性依赖于pH环境——在碱性条件下（pH＞10），刚果红与淀粉样物质的结合力最强，而在酸性环境中易解离。
试剂准备 1. 刚果红染液：称取0.5g刚果红粉末，溶于80ml蒸馏水，加入20ml纯乙醇，搅拌至完全溶解后过滤，避光保存（有效期1个月）。 2. 碱性乙醇分化液：1%氢氧化钠溶于80%乙醇（100ml 80%乙醇加入1g NaOH，现用现配）。 3. Harris苏木素染液：用于复染细胞核，配制后需氧化成熟（加入0.1%碘酸钠）。 4. 封片介质：推荐水性封片剂（如甘油明胶），避免树脂封片剂干扰偏振光观察。 关键细节：刚果红染液配制后需用滤纸过滤，去除未溶解颗粒；氢氧化钠溶液需密封保存，防止吸收二氧化碳失效。
操作步骤 1. 脱蜡与复水
石蜡切片依次浸入二甲苯Ⅰ（10分钟）→二甲苯Ⅱ（10分钟）→无水乙醇Ⅰ（5分钟）→无水乙醇Ⅱ（5分钟）→95%乙醇（3分钟）→80%乙醇（3分钟）→蒸馏水浸洗2分钟。脱蜡不彻底会导至染色不均，可用苏丹黑预染验证。 2. 刚果红染色 切片浸入刚果红染液，室温孵育20分钟。若组织富含胶原（如心脏），可延长至30分钟，但超过40分钟易导至背景过深。 3. 碱性乙醇分化 快速浸入1%氢氧化钠-80%乙醇溶液分化10秒，立即流水冲洗5分钟。此步骤是关键——分化不足则背景浑浊，过度分化则目标信号丢失。新手建议每5秒镜下观察一次。 4. 苏木素复染 Harris苏木素染液浸泡2分钟，流水返蓝10分钟。复染时间过长会掩盖刚果红信号，建议控制细胞核呈淡蓝色为宜。 5. 脱水与透明 梯度乙醇脱水（80%→95%→100%乙醇各1分钟）→二甲苯透明（2次×2分钟）。脱水不彻底会导至切片浑浊，透明时间不足则封片后出现云雾状结晶。 6. 封片观察 滴加甘油明胶，加盖玻片轻压排除气泡。普通光镜下淀粉样物质呈砖红色，胶原纤维淡粉色；切换偏振光模式，淀粉样沉积物呈现苹果绿双折射，背景为暗红色。 常见问题与解决方案 问题1：全片深红无分化  原因：分化液浓度不足或时间过短。 解决：更换新配制的1% NaOH-80%乙醇，分化时间延长至15秒。 问题2：偏振光下无双折射  原因：切片过厚（＞8μm）或封片介质不当。 解决：调整切片厚度至5μm，改用甘油明胶封片。
问题3：背景弥漫性粉染  原因：染色后水洗不充分，残留染液非特异吸附。 解决：分化后流水冲洗延长至10分钟，水流方向与切片平行。 问题4：组织脱落  原因：载玻片未包被或脱水过快。 解决：载玻片提前用多聚赖氨酸处理，脱水时乙醇梯度每步延长至2分钟。 结果解读 •淀粉样变性病：刚果红染色阳性物质沉积于血管壁、间质或器官实质（如肾脏肾小球、心肌间质），偏振光下呈致密苹果绿双折射 •老年斑（阿尔茨海默病）：脑组织切片中可见斑块状砖红色沉积，但双折射较弱，需与炎症灶鉴别。 •假阳性陷阱：纤维素或玻璃样变物质可被染色，但偏振光下无双折射，需结合HE染色和临床病史判断。 特殊样本处理方案 •冰冻切片：省略脱蜡步骤，直接水化后染色，但分化时间缩短至5秒（避免组织溶解）。 •含血样本：染色前用甲醇-过氧化氢溶液（3% H₂O₂:甲醇=1:9）浸泡10分钟，去除红细胞干扰。 •双重染色：刚果红染色后联合HE复染，可同步观察组织结构和淀粉样沉积定位。