做PCR总失败？这6个关键要素90%的人都忽略了！？

笑看风云

一、PCR技术从诺贝尔殿堂到实验室日常

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是分子生物学领域应用最广泛的技术之一。PCR技术由Kary Mullis于1983年发明，但直到 1985 年，PCR 才作为成熟技术正式用于 DNA 扩增。这一技术彻底改变了分子生物学研究，如今广泛应用于基础科研、疾病诊断、农业检测、法医调查等领域。其发明者 Kary Mullis也因这一革命性成果荣获 1993 年诺贝尔化学奖。


Polymerase Chain Reaction (PCR)循环步骤示意图（图源：https://www.researchgate.net/figure/Polymerase-Chain-Reaction-PCR_fig4_376517119）
PCR技术的核心在于其高效性，可在短时间内将单个DNA扩增到成千上万个拷贝。核心步骤包括：：

• 变性：高温（95℃左右）使双链 DNA 解旋为单链；
  
• 退火：退火温度通常为45-72℃，需根据引物Tm值优化，在此温度下引物与单链 DNA 模板的特定区域结合；
  
• 延伸：DNA 聚合酶以引物为起点，在中温（某些高保真酶（如Phusion）的延伸温度为72℃，但Taq酶的常用延伸温度为68-72℃）下沿模板合成新的 DNA 链。
  

二、PCR实验六大核心组分深度解析

PCR反应体系中有6大关键组分，分别是模板DNA、DNA聚合酶、引物、dNTP、Mg2+和缓冲液，它们对PCR实验的成功起着至关重要的作用。

• 模板DNA：DNA扩增的模板可以是多种来源，如基因组DNA（gDNA）、互补DNA（cDNA）和质粒DNA。模板的组成和复杂程度决定了PCR扩增的最佳模板起始量。经过基因工程改造的DNA聚合酶增强了与模板的亲和度，灵敏度更高，所需的模板量更少。过低的模板量会减少PCR的产量，过高的模板量可能造成非特异性扩增，因此DNA模板量的优化尤为重要。
  
• DNA聚合酶：PCR扩增中最关键的组分。Taq DNA聚合酶是用于PCR扩增最广为人知的聚合酶，它的发现变革了PCR的应用。Taq DNA聚合酶有相对较高的热稳定性，在95 ℃有约30-40 min的半衰期。其合成速度约60 s/kb，可扩增约5 kb的片段。所以Taq酶适用于一般的常规PCR。如今，新一代的DNA聚合酶经研发可获得更好的PCR性能，如SuperFi DNA聚合酶、Phusion高保真DNA聚合酶等。
  
• 引物：引物设计是PCR扩增实验的重要环节，需考虑引物长度、退火温度、GC含量及Tm值范围等因素，并避免引物二聚体、3'端特异性、二级结构等。
  
• dNTP：作为合成新DNA链的原料，通常等量加入反应体系中。特殊应用（如随机突变）时，可调整dNTP浓度以促进突变。
  
• Mg2+：作为DNA聚合酶的辅助因子，通常情况下以MgCl2或MgSO4等形式提供，帮助dNTP的结合。
  
• 缓冲液：PCR反应缓冲液可为DNA聚合酶提供合适的化学环境。缓冲液的PH通常在8.0-9.5之间，通过Tris-HCl来调节。
  

三、PCR仪选购六大黄金标准

当然，影响PCR实验成功与否的因素远不止上述6项，还有研究人员的实验熟练度、PCR仪器性能等。作为实验室的基础设备，PCR仪广泛用于基因组研究、物种分类、疾病诊断、生物制药、农业检测和法医调查等领域，不管是分子克隆、基因表达、基因测序还是基因编辑，在流程上都需要使用到PCR仪。一台性能优异的PCR仪器不仅能提高实验的准确性，还能优化人工操作、节省时间，并适配不同的实验需求。
对于仪器的选择，要遵循6个标准：
1. 加热模块温度准确且一致




使用温度验证试剂盒进行模块和热盖温度的测量

• 重要性：变性、退火、延伸的温度精度直接决定反应效率，孔间温差过大会导致结果不可重复。一些PCR仪生产商会遵循美国国家标准与技术研究院（NIST）指定的温度控制规范，并确保测量结果能通过校准链追溯到NIST的国家标准。
  
• 验证方法：定期使用温度验证试剂盒检测模块和热盖温度，由专业人员校准，确保：
  

• 等温模式下孔间温度偏差；
  
• 变温后温度快速恢复至设定值；
  
• 热盖温度（通常 105℃）准确，避免样品蒸发
  

2. 梯度功能升级：从“S型曲线”到线性控温​

梯度温度控制是PCR仪一项可有助于PCR中引物退火优化的功能。梯度设定的目的是在模块之间实现变化的温度，通过每列之间≥2°C的间隔温度升降，使得可同时对于一系列的温度进行测试以获取最佳的引物退火温度。
然而，传统梯度PCR仪通常只采用单一的热模块并通过位于两端的两个加热及冷却元件进行温度的控制。该设计经常会导致以下限制：

• 仅能准确设置两个温度：在热模块的两端设置成引物退火的高、低极限温度，中间区域温度由软件推导算出，因此，无法在模块间实现其他温度的精准设置。
  
• 由于不同列之间的热交换，模块上不同区域之间的温度更可能遵循的是S形的曲线变化而非真正的线性梯度。
  

梯度温度设置 (A) 因为加热模块的设计，仅能设置两个温度：在热模块的两端设置成引物退火的高、低极限温度。 两个温度点的设置是基于计算出来的退火温度（Tm）和不同列之间期望实现的温度差异。 (B) 理论值（真正的梯度） vs. 梯度热模块上实际测量得到的温度。
具有“优于传统梯度”技术的PCR仪可实现更好的引物退火温度控制。该技术的一种形式便是设计带有三个或六个分割金属模块的PCR仪，每一模块都具有独立的加热和冷却元件。相比于梯度模块，该模块设计可带来：

• 独立设置三个或六个不同温度的能力，以便使得每个独立的区域都能进行更好的温度控制，特别是在优化过程中。
  
• 独立金属模块的绝热性阻止了模块之间的热交换。这就可实现更为精准的模块温度控制，确保模块之间实现真正线性的温度变化。
  

3. 样品温度控制：速度、时间与算法的平衡

PCR仪对于样品温度控制的能力对于PCR检测结果的准确性和整体性能十分重要。仪器特异性的参数如升降温速度，维持时间以及算法对于预测样品温度（包括模块温度都是准确控制样品温度的关键。
PCR仪的升降温速度意味着在一定时间内发生的PCR步骤之间的温度变化，并通过用摄氏度每秒(°C/s)作为单位。相应的“升温”和“降温”分别代表着热模块的加热和冷却过程。
由于热量从模块传输至样品需要一定的时间，样品实际的升降温速度会较慢（相对于模块）。因此，对于变温速度的定义需要进行区分和了解。

• 最大或峰值模块升降温速度代表在进行升降温过程中非常小的一段时间内模块可以达到的最快温度变化。
  
• 平均模块升降温速度代表在一段更长的时间内温度变化的速度，对于PCR仪的速度会提供一种更具代表性的测量。
  
• 最大样品升降温速度及平均样品升降温速度反映的是样品实际获得的温度。 因此，样品升降温速度会为PCR仪的性能以及其对于PCR结果的潜在影响提供一种更为准确的比较。
  

由于PCR仪的升降温速度会对PCR结果产生影响，当进行PCR仪更换时，推荐使用带有可模拟之前模式升降温速度程序的仪器，以实现更为轻松的过渡并对PCR的重复性产生最小的影响。


模块和样品的升降温速度 模块的热过冲可让样品更快达到期望的温度。 橙色和蓝色散点曲线描绘了在没有模块热过冲的情况下模块和样品的温度。
PCR仪应该被设计成只有样品达到设置的温度后才对相应的步骤开始计时。这样维持时间，或样品维持在设定温度的时间，将会与操作流程中要求的相应循环条件保持得更加准确。
PCR仪通常会使用复杂的数学算法来确保样品可按照预设程序快速地达到设置的温度。根据反应体系的体积以及所使用的PCR塑料耗材的厚度，算法可对样品的温度以及达到设置温度所需的时间进行预测。依靠这些算法，PCR仪在加热或冷却的过程中，通常会通过一个叫做热模块过冲或下冲的过程让模块温度超出设定值。 这样的设置可以确保样品尽快达到设定的温度，而自身不会发生过冲或下冲。
4. 通量灵活：从小规模到自动化

在一定时间内可以在PCR仪内进行的反应数对于PCR实验的效率十分重要。 可提升PCR仪通量的因素包括升降温速度、热模块构造以及自动化平台的整合。
PCR仪的升降温速度代表了其达到设置温度的速度。升降温速度越快，PCR运行的速度就会越快，也就是在一定时间内可以完成更多的实验。此外，使用可更快合成目标DNA的DNA聚合酶也可对高通量实验进行加速。


PCR仪的升降温速度以及DNA聚合酶的合成速度影响PCR运行时间。 (A) 升降温速度越快，升降温时间越短。 在较低的升降温速度（如1–3°C/秒）时，PCR运行时间的影响更为显著。 该案例中使用的均为假设值，循环时间指的是操作流程时间。 (B)使用具有更快合成速度的DNA聚合酶将会导致更短的循环时间和PCR运行时间。
PCR仪模块的设计对于PCR实验的设置也至关重要。例如，可替换的模块就可为每轮运行带来样品数量上的灵活性。此外，具有可单独控制的多个模块的加热模块是在一台PCR仪上同时运行不同PCR程序的理想选择。


具有三种独立可控模式的PCR仪模块
对于自动化的高通量PCR，PCR仪应该可编程并兼容控制移液处理系统的软件。自动化PCR仪是进行高通量PCR反应的理想选择，因为其可以在几乎没有人为干预的情况下持续不断地运行，因而将手工实验设置所需的时间最小化，并提高在一定时间内可反应的数量。
因此，对于比较简易而灵活的自动化平台进行整合的需求是存在的，从而实现移液处理或板堆叠的完全自动化操作。
5. 可靠性验证：从实验室到极端环境

除了性能和通量能力外，PCR仪也应当能够承受一定的重复使用、环境压力以及运输条件。一些生产厂商可能会对仪器如何进行可靠性和耐久性的检测进行过报道。相应的PCR仪检测包括：

• 组件可靠性：机械装备会被用于对经常使用的仪器组件如热盖、控制面板/触摸屏以及温度循环模块进行重复的测试。
  
• 环境压力：可使用环境舱来模拟常规实验的不同条件，如温度、湿度以及海拔。
  
• 运输检测：可根据国际安全运输协会（ISTA)标准进行激烈的冲击和振动检测，以确保仪器可在无受损的工作条件下运达。
  

PCR仪的耐久性测试
6. 售后服务：免除后顾之忧

尽管有严格的可靠性和耐久性测试，PCR仪在仪器的使用寿命周期内仍然不可避免地会存在技术性问题。为了消除后顾之忧，在进行购买仪器时应该考虑由生产厂商所提供的质保、服务和维护。需了解：

• 服务的灵活性如上门/返厂维修，远程监控服务，维修过程中的替代仪器等，来最大降低对于工作效率的影响。
  
• 质保期的长短，服务的周转时间，技术支持的可接触度，以及专业支持人员的技能和知识。
  
• 仪器安装、操作、合作、验证的可行性来满足实验室和相关规定的要求
  
• 可获取如温度验证、检测、校准和清洗的维护服务以确保仪器正常发挥相应的参数性能
  

作为现代生物技术的基石，PCR在基因编辑、精准医疗等领域的应用持续拓展。随着酶工程、仪器智能化的进步，PCR正朝着更快速、更精准、更高通量的方向演进。赛默飞的PCR仪以精准温控技术为核心优势，结合智能化算法实现样品温度的实时预测与动态调整，显著提升实验重复性与效率。其仪器设计兼顾高通量灵活性与自动化兼容性，支持从基础科研到临床诊断的多元化需求。此外，赛默飞提供的全生命周期服务为实验室稳定运行保驾护航，助力用户应对极端环境与高强度实验挑战。未来，随着基因分型、病原体快速筛查及分子克隆等需求的增长，赛默飞等企业的技术突破将持续推动PCR技术突破边界，新一代PCR仪将更高效地支持遗传育种的基因筛选、传染病的快速病原鉴定、癌症相关突变的基础研究等应用场景，为科研与临床提供更稳定的工具支撑。了解更多产品及服务详情，可访问：https://s.c1ns.cn/PwVkJ），我们会安排专家团队为你提供专业的产品服务和技术支持，更有赛默飞PCR促销活动，访问：https://s.c1ns.cn/mthsN，解锁超值好礼，助力你的科研之路！

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