小知识 | PCR直扩，简单快捷的鉴定手段

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导语：直扩/直接PCR（Direct PCR），是一种不需要额外提取DNA就能够实现体外DNA扩增的技术，省去提取基因组DNA的繁琐程序，可以直接应用于PCR的快速检测。



金沙生物直扩PCR流程示意图

常规的PCR反应需要以高质量的核酸为模板进行反应，如模板中有样本抑制物或提取试剂组分残留时就会抑制PCR反应的顺利进行。而直扩PCR与其的主要区别在于，样本可不经过核酸抽提，直接进行PCR反应，因此对于参与直接PCR反应的酶的耐受性和buffer的兼容性有较高的要求。此外，直扩PCR试剂盒里裂解液对样本的裂解能力也十分重要。
01 直扩PCR使用场景

在做分子实验时，什么情况下建议使用直扩PCR而不是常规PCR呢？
1） 只需要提取样品基因组DNA进行PCR、分子克隆等实验，不需要长期保存DNA。如基因型鉴定、CRISPR-Cas9阳性鉴定等；
2） 样品量较大时，做PCR鉴定需要保存阳性样本基因组DNA，也可使用Direct PCR进行样本初步筛选，有利于节约时间、成本；
3） 样本量较少，无法使用基因组提取试剂盒提取的样品也可尝试此方法。
02 直扩PCR需要的试剂

1、样本裂解液

样本裂解液可以自己配置，也可以购置。不同品牌裂解液组份的差异会使得裂解能力各有不同，进而裂解时间稍有差异。



金沙裂解液与某进口裂解液裂解时间对比

2、PCR Mix

直接PCR的核心是具有高度耐受的聚合酶。建议选用特异性强、扩增能力强、耐脏性强的DNA聚合酶。



以鼠尾为样品，同步对比金沙与国外竞品试剂盒扩增不同大小的片段(1~9)

3、清除或抑制样本中影响DNA扩增的组份

样本在经过裂解液处理之后，会释放出蛋白质、脂质和其他细胞碎片，这些物质会抑制PCR反应，因此直接PCR需要加入相应的清除或者抑制剂来减弱这部分因素的影响。



用金沙ST111 PCR酶扩增不同基因，分别以金沙裂解液与进口裂解液裂解后的产物为模板



用A、B公司PCR酶扩增不同基因，分别以金沙裂解液与进口裂解液裂解后的产物为模板

结论：金沙裂解液中添加了独特的抑制物中和剂，最大程度降低PCR抑制。
03 直扩PCR类型

直扩PCR最早应用的领域是动植物领域，比如鼠、猫、鸡、兔、羊、牛等动物的血液、组织和毛发；植物的叶片和种子等，用来研究基因分型、转基因、质粒检测、基因敲除分析、DNA来源鉴定、物种鉴定、SNP分析等领域。
这些领域有一些共同的特点，那就是目标基因的含量比较高，核酸提取麻烦，所以直扩PCR不仅能够节省时间，对结果的影响很小，同时也能节省成本。
直扩PCR用于病原体检测，则是近几年的发展起来的。
1、植物直扩试剂盒

通常适用于从普通植物的根、茎、叶等组织样本的直接扩增。部分试剂盒亦可用于种子以及真菌、细菌和酵母菌。对于多糖多酚植物来说，直扩的效果会有所下降，因为糖酚含量过高，抑制PCR的进行。可通过加大裂解液用量、或稀释裂解产物改善扩增效果，如若实验结果依旧不佳，建议提取DNA后进行扩增。
一般样本推荐用量（实际情况请根据自身所用试剂盒为准）：

• 植物叶片、根茎 ≤ 直径3 mm
  
• 植物种子 ≤ 直径2 mm（半粒绿豆大小）
  
• 外壳比较坚硬的种子可进行研磨破碎
  
• 菌落：使用牙签或枪头轻轻粘取单个菌落（菌落痕量肉眼可见即可）
  
• 菌液：≤ 10 µL
  
• 菌丝：使用牙签或枪头轻轻刮取适量新鲜菌丝，避免挑取培养基等其他杂菌物质
  
• 蘑菇等大型真菌 ≤ 直径2 mm
  

样本处理方法（实际情况请根据自身所用试剂盒为准）：
1. 直接扩增法
直接扩增推荐使用鲜嫩的植物叶、茎等。为保证获得足够小且统一的样品，推荐使用打孔器取样，并立即加入PCR体系中，确保样品浸入到PCR反应液中。
2. 加热裂解法
加热裂解法可用于大部分样本：种子，鲜嫩/非鲜嫩的植物叶片等；对于长片段或复杂样本的扩增，优先推荐使用加热裂解处理。
3. 研磨法
取直径1~2 mm叶片/小块种子(小于半粒绿豆)，置于30~50 µL裂解液中，尽量研磨破碎；若实验室配备植物研磨仪，需研磨较大量的植物叶片时，可增加叶片或种子取样量同时使用增加裂解液体积处理。
对照引物（实际情况请根据自身所用试剂盒为准）：
有些试剂盒会搭配对照引物，比如根据维管植物基因rcbL保守区域设计。推荐每次直扩实验时至少设置一组阳性对照，可以检测植物样品是否裂解成功。
产品推荐：
产品名称：Triumfi Plant Direct PCR Kit（金沙生物）
产品货号：SD311
产品特点：操作简便：无需提取基因组 DNA；
                 适用广泛：适用于多种植物组织的直接扩增。
适用范围：基因敲除分析、转基因检测、基因分型等
实验案例：



以水稻叶片为样本，不同长度片段的扩增试验



不同植物组织的扩增试验。N为阴性对照

2、动物组织直扩试剂盒

通常适用于动物组织、细胞等的直接扩增。
一般样本用量（实际情况请根据自身所用试剂盒为准）：

• 鼠尾、鼠耳 ≤ 直径2 mm
  
• 鼠趾 ≤ 直径2 mm（小鼠单个趾甲即可）
  
• 鼠脏器、脑 ≤ 直径2 mm
  
• 斑马鱼、线虫、果蝇等昆虫组织 ≤ 直径2 mm
  
• 细胞数量 ≥ 10^5个
  
• 果蝇、蚊子等昆虫的翅膀、腿、线虫等较小的组织，可适当减少裂解液；
  
• 昆虫等包被坚硬外骨骼，建议提前破坏外骨骼使裂解效果更佳。
  

样本处理方法（实际情况请根据自身所用试剂盒为准）：
1. 直接扩增法
直接扩增适用于含细胞的体液，如唾液、羊水等，或收集悬浮的动物细胞。
2. 加热裂解法
加热裂解法适用于动物组织、鼠尾和耳、昆虫、线虫、鱼鳍和表皮，毛发等各种新鲜或者冷冻样品。对直接法扩增不佳的体液类样本，也可采用加热裂解法处理。
对照引物（实际情况请根据自身所用试剂盒为准）：
有些试剂盒会搭配对照引物，比如根据维哺乳动物基因sox21保守区域设计。推荐每次直扩实验时至少设置一组阳性对照，可以检测样品是否裂解成功。
GC buffer（实际情况请根据自身所用试剂盒为准）：
有些试剂盒可能还会含有GC buffer组分，用于扩增片段GC含量（＞65%）时添加。

未完待续~

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