分子技术#∣终于有人将PCR一次性介绍清楚啦！

虎威将军

分子实验难，小优来相伴！哈喽，我又来啦，小优子今天带大家一起来了解PCR，相信大家都不陌生，已经了解到核酸检测利用的技术就是PCR！话不多说，今天就让我们揭开它的神秘面纱吧，到底是怎么个一回事呢？

分子实验技术流程图


记住这张图，咱们分子的实验兜兜转转就在这里面了，分子技术系列内容也会以上图内容挨个介绍给大家，敬请期待吧！

PCR
01发出疑问？它是什么？
基因是DNA里面真正能够发挥遗传效应的DNA片段。那我们若想要分析/探索基因的遗传信息，则需要大量的DNA片段，例如动物的组织；凶手的毛发、血液、皮肤；古生物；历史残骸；患者的组织；亲子鉴定所需的毛发；植物组织等，可能只能分离出少量的DNA，若想研究其遗传信息，有着很大的阻碍和困难，在1985年，出现了一种方法：可以在短时间内大量复制DNA片段，此方法为PCR，它能将很微量的遗传物质在数小时内扩增数百倍达到检测水平。
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），实验过程是利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物的共同参与下，将该段DNA扩增至足够的数量，以便进行结构和功能的分析。

02它是怎么完成扩增的呢？



以上步骤为一个循环，此时已变成了两条DNA链，约需2~4分钟，每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍，PCR产物的量一般是以指数速率增长的，但后期由于底物dNTP的消耗以及DNA聚合酶的失活等因素，产量会逐渐减少，受到限制。通常一次PCR反应进行30-35个循环，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

03有PCR实验的原理图吗？



注：此图来自百度百科（图里面标注的①②③，对应的是扩增步骤：变性-退火-延伸）

04实验前，我需要提前准备什么？


PS：DNA聚合酶一般分为普通的Taq聚合酶和高保真性聚合酶。若只是判断PCR产物是否存在特异性序列，选普通Taq聚合酶；若想要得到没有任何突变的PCR产物，需选择高保真聚合酶（以上是一般实验思维选择）。另外还需注意，进行T载体连接的时候，要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有A末端的，因此你在T载体连接之前需要进行加A反应。或者直接选用普通的Taq聚合酶（此内容可继续锁定接下来的“分子克隆技术”，敬请期待！）

05可以仔细讲讲引物怎么选择和设计吗？

为什么要设计引物？
PCR本质是在一对引物的介导下，在体外对特定的DNA片段进行快速扩增的技术。设计引物的目的是为了找到一对可以与DNA模板序列互补的核苷酸片段，实现模板序列的有效扩增。

如何设计引物？
以下设计以NCBI网站设计引物为例
首先，进入NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），点击右边BLAST



其次，点击Primer-BLAST，进入设计引物的界面。



然后，此时已进入引物设计页面，开始设置参数。
（1）在对应位置输入基因序列，以及扩增片段大小的最小值和最大值。


（2）选择模板类型以及物种


（3）设置完成后，点击Get Primers，等待页面跳转，右侧可以勾选，开启新页面还是在此页面跳转。


（4）系统会根据数据库对你设置的参数进行比对，出现比对结果，自己检查一下是否正确，无误后，点击提交。
（5）根据引物位置、Tm值、以及靶基因是否正确来选择合适的引物。选择引物时，可提前检索一下“引物设计原则”，在原则范围内，选择适合自己的引物。
（6）复制自己选择的引物，发送给公司合成，之后实验验证一下是否好用即可。

注：以上引物设计是以NCBI网站设计引物为例，还有更多引物设计方法，可自行搜索学习！

怎么寻找设计引物的靶标基因序列呢？
若有基因名称，直接在NCBI里的gene里输入点击搜索，结果里边选择你研究的物种，里边会有这个基因的序列等各种信息，下载即可。
若研究的对象有专门的基因组数据库，也可以直接在该数据库搜索。

06PCR实验步骤是什么呢？



图注：PCR实验流程图

更多推荐：

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/652023430