快速检测生物样本中蛋白含量——Elisa

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前言
酶联免疫吸附分析方法（enzyme linked immunosorbent assay ，ELISA ）是20世纪70年代初期由荷兰学者 Weeman 与 Schurrs 和瑞典学者 Engvall 与 Perlman几乎同时提出的。它的提出及发展是２０世纪以来在生物分析化学领域所取得的最伟大的成就之一 。
ELISA检测是一种免疫检测方法，通常用于测量生物样品中的抗体或抗原，包括蛋白质或糖蛋白。像其他免疫检测法一样，它们依靠抗体与目标的结合来促进检测。Elisa具有特异性强 、灵敏度高 、方法简捷 、分析容量大 、检测成本低等优点 ，一般不需要贵重仪器 ，可简化或省去前处理步骤 ，并且可以提供系列商业化的技术产品 ，具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和很高的灵敏度 ，非常适宜于复杂基质中特定组分的分析 。目前 ，ELISA 快速检测试剂盒 、试纸条等已得到广泛应用。



技术原理
ELISA 技术基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。将抗原或抗体结合在固相载体表面并保持其免疫学活性，此外将抗原或抗体进行酶标记，使其既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，待测样品（含有要检测含量的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体发生抗原抗体反应，特异性结合形成复合物。之后通过洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中未反应的其他物质分离。再加入酶标记的抗原或抗体，通过抗原抗体反应而结合在固相载体上。此时固相上的含酶量与样品中待检物质的量呈正比。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与样品中待检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。



方法分类
Elisa包括双抗体夹心法 、直接法、间接法 、竞争法 、捕获法等 。


1、直接法(direct ELISA)
将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可测定抗原总量，此一级抗体的特异性非常重要。
优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。
缺点：试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。
2、间接法(indirect ELISA)
此测定方法与直接法类似，差别在于一级抗体没有酶标记，改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。
优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它更多的免疫反应性。
缺点：交互反应发生的机率较高。
3、双抗体夹心法(sandwich ELISA)
被检测的抗原包被在两个抗体之间，其中一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量；或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体必须小心选取，才可避免交互反应或竞争相同的抗原结合部位。
优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。
缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。
4、竞争法(competitive ELISA)
样本里的抗原(自由抗原)和纯化并固定在固相载体上的抗原(固定抗原)一起竞争相同的抗体，当样品里的自由抗原越多，就可以结合越多的抗体，而固定抗原就只能结合到较少的抗体，反之亦然。经清洗步骤，洗去自由抗原和抗体的复合物，只留下固定抗原和抗体的复合物，拿来与只有固定抗原的对照组结果相比较，根据呈色差异就可计算出样品里的抗原含量。
优势：可适用比较不纯的样本，而且数据再现性很高。
缺点：整体的敏感性和专一性都较差。
5、新ELISA技术：基于细胞法(cell-based ELISA)
是一种新的定性蛋白检测技术，将细胞直接在微孔板里培养，待检测时，不需抽提蛋白和裂解细胞，便可直接测量微孔板里蛋白经刺激或抑制作用后的变化。
优势：无需裂解细胞，所以目标蛋白损失*少，可测定完整细胞、黏附细胞、还有非粘附细胞。
缺点：不能测定抗原量。
在目前的生物学研究以及临床诊断等领域 ，双抗体夹心法及竞争法占到免疫分析的 ８５％ 以上 。
实验流程
1、准备试剂、样品和标准品
2、加入准备好的样品和标准品，37℃反应30分钟
3、洗板5次，加入酶标试剂，37℃反应30分钟
4、洗板5次，加入显色液A、B 37℃显色10分钟
5、加入终止液
6、15分钟内读OD值
7、计算目标含量



Elisa实验流程


通过标准品蛋白含量与OD值的关系，制作标准曲线。
将样本所测OD值代入标准曲线，即可求得样本所含对应蛋白的含量。

结果展示



原始读数（OD值）



标准曲线分析



样本实际蛋白浓度计算（ng/ml）

ELISA检测的应用


1、疾病诊断
包括针对人类免疫缺陷病毒（HIV）的快速抗体筛选测试，COIVD-19病毒以及其他病毒，细菌，真菌感染等，都可以通过Elisa测定进行疾病诊断。
2、食物过敏原的检测
过敏原如果被受影响的人摄入，可能是致命的，所以对于食品来说，宣布不含某些过敏原，如花生[20]，是至关重要的。ELISA为此提供了极好的灵敏度，在某些情况下可低至百万分之一（ppm），并且能够应对一些食品类型，如油和奶，而其他方法如PCR则难以应对。
3、生物制药检测
随着生物仿制药的发展，有必要证明它们与它们要模仿参考药物之间的相似性。在这里，ELISA也发挥了在确定药物总浓度和检测杂质等因素方面的效用。
4、癌症生物标志物测试
癌症生物标志物通常可以在血液样本中检测出来。因此，ELISA测试可以作为一种非侵入性的方法，用来测定和量化已知的生物标志物。
5、法医药物检测
ELISA检测可被毒理学家用于筛选法医样品中的滥用药物痕迹，包括安非他命、可卡因、鸦片制剂、美沙酮、苯并二氮杂卓和大麻素。虽然液体样品，如尿液或血液比较容易处理，但也可以对固体样品，如头发，进行ELISA分析。
6、怀孕测试
人绒毛膜促性腺激素（hCG）是怀孕时产生的一种激素，可以通过ELISA在尿液样品中检测。
7、自身免疫性疾病
指示自身免疫性疾病的标志物，如类风湿性关节炎和红斑狼疮，可通过ELISA测定和定量。
8、实验室和临床研究的检测
对于实验和临床研究中样本中的各种抗原抗体，可通过ELISA测定和定量。

目前的Elisa检测可以同时进行大量样品的检测，并可在酶标仪上迅速读出结果。快速、高效、性价比高、结果准确，想要测定血清、血浆、尿液、细胞、组织等样本中抗原抗体含量的小伙伴们还在等什么呢？心动不如行动！

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