求各位老师，条件培养基的制备方法？

空白派

我需要处理A细胞3天，3天后收集A细胞的培养上清，对已经处理的B细胞进行共培养。
1.条件培养基的制备，是需要在收集A细胞上清前换成新的无血清A培养基进行处理吗？
2.对B细胞进行共培养的话，条件培养基加入前，是需要把B细胞的培养基换成无血清B培养基进行处理吗？
3.若是对A细胞培养基不进行收集前换液的处理的话，那A细胞上清就相当于3天没换液的条件培养基了，但很明显，酚红颜色已改变，PH值也有变化，这样的条件培养基上清，能够直接应用吗？
4.收集的条件培养基，是进行离心后存放于-80℃，用時再复温吗？



原文地址：https://www.zhihu.com/question/659500629

卡卡

方案摘要：在一定培养条件下能发酵乳糖，产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。本方法利用RAYPA培养基自动分装仪快速制备实验所需的培养液、蛋白胨水以及无菌水等，保持无菌环境、控制温度避免琼脂凝固，以提升计数的准确性和操作效率。


方案详情：
一、实验原理
大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色带有或不带有沉淀环的菌落，培养基自动分装仪通过无菌环境控制、精准定量、温度维持、自动化操作等原理，解决了大肠杆菌平板计数法中人工操作的痛点（如污染风险高、效率低、误差大），尤其适用于实验室的高通量检测需求。其核心价值在于通过技术手段提升计数结果的准确性、重复性和操作效率，同时降低实验人员的劳动强度。


二、实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
①  恒温培养箱：36 ℃ ±1℃。
②  冰箱：2 ℃~5 ℃。
③  恒温水浴箱：46℃±1℃。
④  天平：感量 0.1 g。
⑤  均质器。
⑥  振荡器。
⑦  无菌吸管：1 mL(具 0.01 ml 刻度)、10 mL(具 0.1 ml 刻度)或微量移液器及吸头。
⑧  无菌锥形瓶：容量 500 mL。
⑨  无菌培养皿：直径 90 mm。
⑩  pH计或pH比色管或精密pH试纸。
⑪ 自动菌落计数仪SHASHIN KAGAKU，PSF-2100。
⑫  蠕动泵分液器：fluidot  600D
⑬  电动移液器  pipetty 10mL
⑭ RAYPA培养基自动分装仪


2、培养基和试剂
① 月桂基硫酸盐胰蛋白胨( lauryl sulfate tryptose，LST)肉汤。
② 煌绿乳糖胆盐( brilliant green lactose bile，BGLB)肉汤。
③ 结晶紫中性红胆盐琼脂( violet red bile agar，VRBA)。
④ 无菌磷酸盐缓冲液。
⑤ 无菌生理盐水。
⑥ 1 mol/L NaOH 溶液。
⑦ 1 mol/L HCl溶液。


三、检验程序
1、大肠菌群平板计数法的检验程序如下：


四、实验步骤
1、样品稀释
固体和半固体样品：称取 25g样品，放入盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ，8000 r/min~10 000 r/min 均质1 min~2 min，或放人盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min~2 min，制成1：10 的样品匀液。
液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL，样品置盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1：10 的样品匀液。
2、样品匀液的pH应在 6.5~7.5之间，必要时分别用1 mol/L， NaOH 或1 mol/L HCl调节。
3、使用Pipetty电动移液器吸取1：10 样品匀液1mL沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
4、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
5 、选取2个~3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
6、及时将 15 mL~20 mL融化并恒温至 46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂( VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL~4 mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。
7、选取菌落数在15 CFU~150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm或更大，最低稀释度平板低于15 CFU 的记录具体菌落数。


8、从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养 24h~48 h，观察产气情况。凡 BGLB肉汤管产气即可报告为大肠菌群阳性。
五、结果及报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例：10-'样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100x6/10X10'/g(mL)=6.0X10’CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。