单细胞功能蛋白质组学微流体研究进展（下）

微流控芯片

4.基于质谱的全球单细胞蛋白质组学分析技术

已经投入了大量努力来提高非靶向蛋白质组学工作流程的灵敏度，以达到具有良好覆盖率、鲁棒性和可靠性的单细胞分辨率。与基于亲和力的方法相比，非靶向蛋白质组学分析允许对细胞蛋白质组进行全局映射，因此是面向发现的基础研究和临床研究的理想选择。各种样品制备方法、自动化仪器和LC-MS开发的最新进展使我们能够使用无标记方法对单个细胞中的1000多种蛋白质进行定量。在下文中，我们将讨论这些令人兴奋的发展，其中包括简要讨论用于单细胞分析的LC-MS系统的演变、微流体支持的上游样品处理以及随后的数据采集和分析工作流程（图4）。

4.1微组学和单细胞蛋白质组学的MS进化

基于MS的蛋白质组学无疑是大规模分析蛋白质组的组成、结构和动态变化的最全面的方法，它可以提供蛋白质与生物学或疾病的功能联系和分子机制。它已被广泛应用于各种样品（如细胞系、动物模型和人类临床标本）的蛋白质表征、翻译后修饰和蛋白质动力学。它在蛋白质生物标志物发现方面的实施激发了提高蛋白质组学分析灵敏度的巨大进步，以克服临床标本的分析挑战，这些标本通常以微量存在，如初级免疫细胞和稀有细胞的子集。虽然基于MS的蛋白质组学已经鉴定出从微尺度（微克，>1000个细胞）到大样本的>103-104种蛋白质，但以MS为中心的SCP主要受到缺乏小型化样品处理方法、高效分离策略和灵敏的MS仪器的阻碍。随着小型化样品制备的最新进展以及LC分离和MS仪器的改进，对单个细胞的灵敏测量的追求一直在迅速扩大。以下部分将讨论这些进展，并详细介绍基于微流体的SCP分析。

小型化样品制备在传统的蛋白质组学工作流程中，通常需要大量的样品（>105个细胞；20μg至1 mg蛋白质），到小规模的微基因组学（<1000个细胞；<1μg蛋白质），大部分努力都集中在改进微管和定制尖端的样品预处理上，以提高分析灵敏度。例如，Kulak等人报道了in-StageTip（iST）方法，其中样品操作是在含有由反相珠制成的非常小的圆盘的尖端中进行的。Manza等人介绍了过滤辅助样品制备（FASP），其中十二烷基硫酸钠（SDS）和其他干扰LC-MS/MS分析的污染物通过分子量截止过滤装置去除。同样，Hughes等人开发了使用表面官能化顺磁珠进行肽脱盐的一锅固相增强样品制备方法（SP3）。这些技术最大限度地减少了样品转移过程，使增强分析能够减少到几百个细胞，蛋白质组学覆盖范围在3500-4500之间。与此同时，Chen等人报道了用于探测100个细胞的集成蛋白质组分析装置（iPAD）（iPAD-100），由此将活细胞注射到装置中以进行后续的蛋白质组学处理和分析。该装置由浸入细胞悬浮液的入口针、控制样品处理过程的10端口阀、用于输送样品的微型注射器、用于蛋白质消化的毛细管回路（长40cm，内径100μm（i.d.））和用于脱盐的C8柱组成。iPAD-100从100个细胞中鉴定出635种蛋白质。后来，该设备升级为SCP分析的集成系统（iPAD-1）。使用4.5倍小的毛细管（内径22μm）作为单细胞输入的关键部件，细胞裂解和蛋白质消化在2nL内完成，结果显示样品损失显著减少。总体而言，iPAD-1从单个HeLa细胞中平均鉴定出180种蛋白质。

LC仪器的进步增强色谱分离和分辨率的显著进步极大地促进了超灵敏蛋白质组分析。已知LC内径的小型化和较低的流速也可以增强分离，从而大大增加向质谱仪的离子输送，并提高检测灵敏度。已经报道了各种窄孔柱，包括在50 nL min−1的流速下内径从75μm减小到30μm，将信号强度提高3倍，超窄孔填充柱在20 nL min-1的流量下内径为20μm，实现单细胞约800个蛋白质的覆盖率，与30 nLC系统相比，使用picoLC系统（2μm内径和800 pl min−2）的灵敏度提高了163倍和10至100倍。μm-i.d.柱。174几个小组报告了用于低输入蛋白质组学的微流控柱阵列柱（μPAC），其由柱间距为2.5μm的较窄柱组成，柱间填充有高度有序的固定C18珠，以250 nL min−1的流速运行，证明了对单个细胞中>1000种蛋白质的一致定量。

5.SCP在生物学和临床研究中的应用

5.1靶向单细胞蛋白测定的应用

我们介绍了各种基于微流体的靶向SCP检测的生物学和临床应用（图5）。由于微流体的独特能力，它们对靶向SCP的实施促进了各种细胞生物学研究和临床研究。例如，CyTOF是靶向SCP分析最广泛使用的方法之一，200提供了探索不同脑细胞中细胞表型的应用（基于信号标记物和细胞因子），免疫细胞分化，基于表面标记物的细胞异质性，和癌症相关信号。 CyTOF与细胞成像相结合，也被应用于探索组织内或细胞过程中单个细胞中蛋白质的亚细胞分布，促进了我们对免疫细胞功能的理解，以用于免疫治疗应用。最近，Neuperger及其同事使用单细胞CyTOF进行了研究。基于13种蛋白质的表达模式的非小细胞肺癌细胞（NSCLC）系中的异质性和肺腺癌中的瘤内异质性。同样，SCBC方法用于测量各种分泌、细胞质或膜蛋白的多重蛋白质丰度（由细胞产生的拷贝数决定）。通过仔细选择和监测特定蛋白质标记的表达，SCBCs可以成为研究多种生物系统的工具。例如，异质性（细胞-细胞变异）可以通过监测参与不同信号通路的关键表型标记、转录因子和信号效应器的差异表达来解决。SCBC方法也被用于通过测量在近距离孵育的细胞释放的分泌蛋白来探索细胞相互作用和通信。这种方法用于了解细胞在不同分离条件下如何相互作用，以及信号蛋白如何影响相邻细胞。选择性蛋白质标记的SCBC分析确实已成为研究功能异质性、117条信号通路、208条细胞间相互作用、207个细胞通讯、119个免疫细胞反应、和CTC分析的有前景的工具。Su等人应用SCBC芯片监测了18种蛋白质，包括表型标记、转录因子、单个黑色素瘤细胞中的信号效应器，以探索药物诱导的信号动力学。这项研究揭示了黑色素瘤在BRAF抑制剂治疗下的表型转变，BRAF抑制剂激活了包括MEK/ERK和NF-κB在内的替代通路，进一步加速了肿瘤进展和耐药性。表型。此外，Ullal及其同事使用SCBC探索了肺腺癌患者的肿瘤间和肿瘤内异质性，并仔细选择了90个靶标志物来覆盖临床中使用的标志性途径（如DNA损伤、细胞死亡）和诊断标志物。

SCP研究正以前所未有的速度蓬勃发展，对超灵敏分析的持续努力受益于多种因素，例如迄今为止讨论的令人兴奋的技术和分析发展。从用户的角度来看，选择最合适的SCP方法可能是针对特定主题的；不太可能有一种适用于所有目的的单一SCP策略。基于亲和力的SCP方法非常适合探测一组特定的蛋白质，这些蛋白质的功能是已知生物现象或驱动疾病进展的关键决定因素。与此同时，基于MS的工作流程提供了无与伦比的功能，允许以发现为导向的研究来研究与关键生物过程相关的蛋白质的组成、丰度和功能状态，并将成为全球蛋白质组分析的有利选择。

到目前为止，靶向SCP方法已经报道了使用CycMIST方法检测同一批单细胞中多达182种蛋白质的分析。毫无疑问，对于基于亲和力的SCP，一个主要的瓶颈是可靠抗体的可用性和特异性，以及相应荧光探针和检测通道的容量和兼容性。为了向前发展，开发更多的正交亲和探针，允许灵活标记和多重化学功能化，将能够以更高的通量研究靶向SCP。靶向SCP的另一种策略是用适配体代替抗体，适配体产生更高的多重性（>1300个蛋白质），而其他指标（如动态范围和特异性）也会受到影响。

考虑到LCN蛋白通常在MS衍生的测量中被掩盖，靶向SCP与新型传感器相结合可能会提供超敏感性的利基。与基于微流体的仪器集成的激光诱导荧光（LIF）和SERS在检测LCN蛋白方面处于领先地位。为了提高多路复用性和吞吐量，其他传感方式也值得考虑。例如，磁阻生物传感是一个很强的候选者，因为它的超灵敏度来自大多数生物样品表现出可忽略的磁背景。这种基质不敏感性大大降低了样品预处理的复杂性。此外，对磁弹性测定法的研究表明，时间特征可以通过改变磁性纳米颗粒的材料和尺寸来增加多路复用性。因此，微流体与磁阻纳米传感器的集成有望有利于LCN方案的目标SCP分析。

MS是全球蛋白质组学分析的核心工具。然而，全球SCP面临着与肽离子向质谱仪的低效输送以及单次运行中分析更多单细胞的有限通量相关的挑战。为了促进使用MS的全球SCP，已经进行了实验和计算工作，以提高分析吞吐量和灵敏度。如本综述所示，SCP技术的最新实验改进一直强调通过最小化样品体积和缩放多个样品的分析来减少样品损失。虽然这些方法提供了整体工作流程的小型化，但它们目前缺乏处理数百个单细胞的吞吐量。为了提高吞吐量，通过TMT标记进行多路复用需要额外的样品处理步骤，以显著提高MS吞吐量。迫切需要一个微流体平台，用于无缝集成小型化单细胞样品制备和标记，以实现更高通量的SCP分析。提高灵敏度的另一个方面是（1）将肽样品转移到LC和（2）单细胞水平样品的色谱分离的改进，这进一步实现了向MS仪器的有效离子输送。在这个利基市场中，微流体装置可以直接与LC-MS/MS结合，以进一步增强单细胞鉴定深度。从长远来看，基于微流体的分离、分馏和电离与质谱的直接耦合可以进一步避免耗时的LC分离的需要。另一方面，微流体装置可以功能化或填充适当的富集珠/材料，以从低样本量（甚至单细胞）中富集翻译后修饰的蛋白质（如磷酸化或糖基化的蛋白质），或纯化（通过分选和分离）稀有细胞，如CTC，用于后续的SCP分析，以鉴定新的药物靶点和生物标志物。此外，自动柱组成（C18颗粒或μPAC）、柱长、梯度时间、流速和其他与LC正交的方法是高灵敏度“无损”SCP需要考虑的关键领域。结合上述能力，指定的数据采集策略和适当的数据分析管道（如样本大小的库）前瞻性地最大限度地提高了大规模临床SCP的蛋白质组学深度、再现性、灵敏度和吞吐量。

除了基于微流体的工作流程的改进外，分析下游SCP数据的标准化计算管道也很有趣。目前的光谱数据处理方法表现出有限的识别率、相对耗时的库构建和吞吐量，这影响了从SCP数据中提取生物关键信息。为此，基于深度学习的模型可以与计算管道一起使用，以提高识别能力，并生成预测库，以尽可能少的资源补充实验库。

在目前的蛋白质组学深度，SCP技术已经在单细胞分辨率上展示了几种应用。这些应用已经从细胞系扩展到单个细胞水平的空间分辨肿瘤组织。这些研究大多集中在样品制备的改进或数据采集策略的优化上，最新技术使每个细胞能够鉴定1000-1500种蛋白质。为了应对微基因组学，最近，plexDIA将非等压质量标签与DIA相结合，分析纳克级样品，从而提高吞吐量，并以98%的数据完整性量化每个细胞约1000种蛋白质。展望未来，SCP MS有望实现测量数千多种蛋白质和量化单个细胞中功能相关蛋白质的目标，这将进一步促进SCP在更广泛的生物系统中的应用，并指导医学的未来。这一进展反过来将加速诊断疾病和探索癌症治疗药物靶点的临床检测的发展。最近的SCP发展也有可能改变发育生物学。随着从典型哺乳动物细胞中鉴定出1000多种蛋白质，基于微流体的方法有望从卵母细胞或早期胚胎等大型细胞中检测出数千种蛋白质。通过上述改进，SCP将为干细胞分化、早期胚胎发育和器官发育提供有价值的见解。

随着微流体细胞检测技术的进步，单细胞的微操作验证了核酸和蛋白质的可控取样，为动态细胞生物学的研究铺平了道路，其中细胞间通讯、微环境调节和时空细胞动力学被揭示。由于仅依赖单体信息有限地回答和连接了基因型和表型之间潜在的生物不确定性；CITE-seq和nanoSPLITS 等几项工作将蛋白质组学工作流程与成熟的单细胞RNA测序技术相结合，实现了双模分析。最近，各种微流体平台（无论是液滴还是微孔）已经提出了多模态分析，由此产生的大数据框架需要在生物信息学上实施深度学习，这在计算上推动了多组学时代的到来。展望未来，预计多层微流体可以设计为容纳多个功能模块，用于进行多组学或动态细胞生物学实验。

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