外泌体分离技术

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外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡，是一种直径为30-150nm的纳米级脂质结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。
近年来，外泌体在基础医学与临床应用的研究不断深入，涌现出多种分离方法。常用的外泌体分离方法包括超速离心法和聚合物沉淀等。
一、超速离心法
超速离心法（Ultracentrifugation）是一种基于物理性质的用于分离分散在溶液中的不同生物颗粒，如细胞、细胞碎片、亚细胞器、蛋白质和核酸等广泛使用的技术，通过使用超速离心机在极高转速下根据密度和大小分离目标产物。原始溶液通常包含多组分混合物，这些颗粒大小和密度差异使得其沉降速度也不同，所以能够有效地将混合物中的不同成分分离开来。颗粒在离心管中高速转动时，其速度由离心力、阿基米德浮力和斯托克斯粘性阻力这三种力的平衡决定，在转速和介质成分固定的离心条件下，颗粒速度完全由颗粒的形态和密度决定：当颗粒密度大于介 质密度时，颗粒沿着离心力的方向“向下”沉降，颗粒密度小于介质密度则颗粒沿着与离心力相反的方向“向上”漂浮；在密度相似的情况下，尺寸较大的颗粒移动得更快。
超速离心法在外泌体研究领域迅速发展，其操作简单、重复性高的特点使其成为外泌体分离最常用的分离技术之一。
如图1所示，超速离心的过程主要分为两个部分：
首先是进行一系列的中低速离心，去除死细胞、细胞碎片和大尺寸的细胞外囊泡，然后超速离心分离外泌体，去除可能造成污染的蛋白质和其他杂质。沉降系数（sedimentation coefficient，S）是衡量物质在离心力场中沉降速率的一个参数，可以通过施加的离心力与离心时间计算得到。外泌体S值较小，常施加的离心力约为100,000至200,000g，时间为45至150分钟。



图1 超速离心法分离外泌体。首先中低速离心去除细胞和细胞碎片等大的颗粒，然后通过高速离心分离得到外泌体沉淀

超速离心法获得的外泌体中，非外泌体蛋白的含量可能高达50%以上，这严重影响了后续的功能研究和临床应用，同时研究表明，调整离心速度、时间和温度，可以减少外泌体损伤和杂质共沉淀。
二、聚合物沉淀法
目前市场上大部分的商用外泌体分离试剂盒都是基于聚合物沉淀法所开发的。聚合物沉淀法的原理是利用亲水聚合物与外泌体的亲水相互作用，在外泌体周围形成疏水微环境，降低外泌体的溶解度，在1500g的低速离心条件下沉降获得外泌体。亲水聚合物聚乙二醇（PEG）以其能够改变水溶性且无毒的特性成为绝大部分外泌体分离试剂盒的选择，被添加到样本中并在4℃下孵育 15分钟至12小时。低速离心使该方法避免了复杂的设备与繁琐的操作步骤，回收率高，无论是大样本量还是小样本量均适用，产量高。有研究表明，该方法的可扩展性高，可用于高通量样品的制备。 然而，该技术也带来一些共沉淀物杂质，如免疫复合物、脂蛋白、病毒、核酸等，同时在最终产物中的聚合物材料也无法去除，不利于后续的研究。一些报告表明，与超速离心法相比，使用PEG沉淀分离的样本中外泌体活力降低，这表明共沉淀物质可能具有毒性或拮抗作用。

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