qPCR技术系列一：实时荧光定量PCR（qPCR）技术原理与应用

HaHa

你是否好奇，新冠检测中的“核酸检测”是如何快速锁定病毒RNA的？答案就藏在qPCR技术中！今天，我们就来揭开这项“幕后功臣”的神秘面纱！

01 技术概述
实时荧光定量PCR（Quantitative PCR, qPCR）是一种结合传统PCR与实时荧光检测的核酸扩增技术。自1996年首次报道以来，该技术凭借高灵敏度、高特异性、定量准确及操作简便等优势，迅速成为分子生物学、医学诊断、食品安全等领域的核心工具。值得注意的是，qPCR也称为Real-Time PCR，但需与RT-PCR（Reverse Transcription PCR）严格区分，后者特指以RNA为模板的反转录PCR技术。
02 技术原理
qPCR通过荧光标记物实时监测PCR循环中核酸扩增的动态过程，定量分析初始模板浓度。反应过程可分为四个阶段：
1. 基线期
○ 初始循环阶段，荧光信号受背景噪声干扰，呈低水平波动。
2. 指数增长期
○ 目标序列呈指数级扩增，荧光信号与扩增产物同步增加，是定量分析的关键区间。
3. 线性增长期
○ 受限于dNTP消耗、酶活力下降及产物抑制等因素，扩增效率逐渐降低。
4. 平台期
○ 反应体系趋于饱和，荧光信号趋于稳定，无法反映模板量信息。


关键参数：
● 荧光阈值
荧光定量PCR仪通常将荧光阈值自动设置为基线期荧光值标准差的10倍。其存在的目的主要是将相关扩增信号从背景中区分出来。荧光阈值遇到特殊情况可以手动调整，但需要保证阈值线与扩增曲线的交点位于指数增长期。
● Ct值
Ct值是指荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数，在扩增曲线图上显示为扩增曲线与荧光阈值线交叉点所对应的横坐标。CT值可用于计算起始DNA拷贝数。模板起始量与CT值成负相关，模板起始量相差2倍，CT值的差异通常为1左右；靶标起始量相差10倍，CT值的差异通常为3.33左右。
定量分析原理：
qPCR采用 标准曲线法 实现绝对定量：
1. 构建标准曲线
○ 使用已知浓度的标准品（如质粒DNA或cDNA）进行梯度稀释，同步扩增并绘制 CT值-模板浓度对数 曲线（斜率应接近-3.3）。
2. 样品定量
○ 通过待测样本的CT值在标准曲线上线性插值，计算初始模板拷贝数。



03 荧光标记方法
1.非特异性染料法
以SYBR Green I为代表，SYBR Green I 是高灵敏度的非特异性双链DNA荧光染料，具有绿色激发波长。它以非特异性方式结合在双链DNA双螺旋小沟区域。游离的SYBR Green I 只发出极弱的荧光信号，PCR过程中，当扩增生成双链DNA时，SYBR Green I与dsDNA结合，荧光信号被千倍放大，荧光信号的强度与扩增得到的双链DNA的浓度成正比。
○优点：通用性强、成本低。
○缺点：由于它以非特异性方式与双链DNA结合，易受非特异性扩增（如引物二聚体）干扰，需通过熔解曲线分析验证产物特异性。
2.特异性探针法
以TaqMan探针法为主，探针两端分别标记报告荧光基团和淬灭基团。在正常条件下，探针完整时，荧光染料靠近淬灭剂，从而抑制或淬灭染料的荧光信号。在PCR扩增时，模板DNA变性解链，Taqman探针特异性结合到目标基因处，而Taq酶具有5’—   3’核酸外切酶活性，延伸至探针结合处，可将探针水解，使荧光报告基团和淬灭基团分离，从而检测到荧光信号，荧光信号的强度与扩增得到的双链DNA的浓度成正比。
○优点：高特异性，适用于病原体检测、SNP分型等高精度场景。
○缺点：探针设计较复杂，成本较高。


04 技术优势
1、高灵敏度和特异性：qPCR能够检测到极低浓度的DNA或RNA，甚至单个病毒颗粒，提供高特异性的定量结果。
2、实时监测和定量分析：通过荧光标记物，qPCR能够实时监测PCR反应过程，精确计算反应效率，并用于基因表达的定量分析。
3、快速检测：qPCR可以在几个小时内完成检测，相比传统方法（如病毒感染实验）大大缩短了时间。
4、成本效益：在分析大量样本时，qPCR的成本效益较高，因为它提供了灵活且具有成本效益的技术选择。
5、自动化和通量：qPCR的高通量应用和自动化能力使其在实验室和监管环境中更为人所知，适用于多种研究需求。
05 技术应用
qPCR技术因其高灵敏度和特异性，已广泛应用于多个领域：
• 医学诊断：用于病原体检测、基因表达分析、疾病早期诊断等。例如，在新型冠状病毒检测中，qPCR技术可快速、准确地检测病毒RNA。
• 分子生物学研究：用于基因表达调控、基因拷贝数变异分析等。
• 食品安全检测：用于检测转基因成分、病原微生物等。
• 动植物检疫：用于检测动植物病原体。

qPCR技术作为一种强大的核酸定量分析工具，凭借其高灵敏度、高特异性和快速定量的特点，已成为分子生物学和医学研究中不可或缺的技术手段。随着技术的不断发展和优化，qPCR在更多领域的应用前景将更加广阔。

<hr/>

https://work.weixin.qq.com/u/vc2de02e443069b30d?v=4.1.33.39300&bb=651bdcb93e (二维码自动识别)
PCR产品研发顾问，欢迎咨询！
联系方式：
电话:13761728614(微信同号)
公众号：PCR Magician
邮箱：sensobio@sensobio.tech

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/1890881633009247460