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[分享] Western Bloting实验结果背景太高怎么办?

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发表于 2025-4-2 10:47 | 显示全部楼层 |阅读模式
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发表于 2025-4-2 10:47 | 显示全部楼层
尝试改变封闭剂,优化封闭时间,适当降低抗体浓度。
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发表于 2025-4-2 10:48 | 显示全部楼层
硕博连读的我,已经做了5年的Western Blot,师弟师妹咨询WB操作过程中遇到的问题数不胜数。如今,丫丫我将这些细节和问题展示出来供大家参考。
WB过程的几个阶段:


1、蛋白质的提取
2、蛋白浓度测定
3、WB的操作过程(电泳、电转、封闭、一抗、二抗及发光)
现在就从这几个步骤中需要的注意事项跟大家讲讲:
蛋白质提取的操作和注意事项
011.1组织蛋白提取实验步骤大致分为:预冷lysis buffer→研磨→混悬→超声→离心注意事项:(1)其中蛋白酶抑制剂的种类大致有:PPI、NaF和PMSF等,在组织提取的时候一般加入PPI,在加入lysis buffer时前就加入蛋白酶抑制剂。021.2 细胞蛋白提取实验步骤大致分为:培养液去除→PBS清洗细胞→加蛋白裂解液→用枪单孔加入裂解液并吹散→枪头刮板(斜圈)→用枪头裂解液冲刷板孔干净并装入新EP管并放置冰上→超声→离心→放置冰上注意事项:(1)加裂解液PMSF,现配现用,且最后再加入(2)用PBS清洗细胞时,不可碰壁和细胞,需沿壁缓慢注入,防止污染
总结
在蛋白质提取的这一阶段中,裂解液的选择尤其重要,里面一般含有去氧胆酸钠和NP-40、Triton-x-100和SDS,这些都是去污剂,根据以上药品加入的浓度可将裂解液分为强中弱三种,要根据实验目的和组织类型加入不同强度的裂解液。Kevin在发表的文献中也曾提过:裂解液的条件对蛋白质的质量和保存条件有重要影响。如:用纯非离子洗涤剂(Triton X-100或NP-40)裂解细胞或组织会导致一些蛋白质在离心后分裂成可溶性和不溶性(颗粒)部分。放射性免疫沉淀法 (RIPA) 缓冲液(含有稀释的十二烷基硫酸钠(SDS,一种变性洗涤剂)和脱氧胆酸盐(蛋白质-蛋白质相互作用的破坏物))被广泛用作全细胞提取的裂解缓冲液。但尽管如此,RIPA缓冲液裂解仍然产生不溶性部分。因此,在做蛋白互作筛选实验时,更需要注意选择裂解液类型了。
下面通过一篇文献看看裂解液条件如何影响免疫印迹结果的。


RIPA裂解液不溶性不仅局限于细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白,而在转录因子GATA2和细胞-细胞粘附蛋白、β -连环蛋白也存在。因此,在WB之前,需先确定目标蛋白质,再选择合适裂解液。了解各种裂解缓冲液中的蛋白质溶解度是做WB成功的关键!


在这一步骤中,最关键和需要注意的地方就是选择裂解液的问题。(1)裂解物蛋白的稳定性和翻译后修饰也会受到混合细胞酶(蛋白酶和磷酸酶)活性的影响


由于篇幅的影响,今天就讲到蛋白质提取阶段。后续接着讲解下一步骤!下周见!
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发表于 2025-4-2 10:49 | 显示全部楼层
1\封闭不充分或者封闭液不合适。(如果目的蛋白是磷蛋白,封闭液不能使用奶粉。)
脱脂奶粉:虽然便宜,但使用范围比较窄,磷酸化抗体也回导致背景增加。因为自身含有生物素,不能用于生物素标记的抗体系统。
BSA: 使用范围广。
血清: 某些血清汇总含有叠氮钠,不适用与HRP酶标的检测体系。
2、抗体孵育浓度过高,时间过长、温度过高。
3、 洗涤次数和时间不够。
4、膜干燥(膜要抑制保持湿润状态)。操作过程要保持膜的整洁,不要用手接触膜和按压膜的任何部位。
5、二抗的肺特异性结合。(做二抗对照排除)
6、显影曝光过度。
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发表于 2025-4-2 10:49 | 显示全部楼层
可能的原因及建议:
(1) 膜没有完全均匀湿透
根据所用的膜使用甲醇或转膜buffer浸透膜。
(2) 膜被污染
禁止裸手触摸膜,拿取膜时,使用镊子夹取膜边缘,避免膜被杂蛋白和油脂
污染。
(3) 封闭不充分
选用合适的封闭液,并且封闭足够的时间。
(4) 洗膜不充分
增加洗液体积和洗涤次数,洗液中添加Triton X-100。
(5) 一抗孵育不当
降低一抗浓度,减少孵育时间,改用低温孵育。换用特异性更好的一抗。
(6) 二抗孵育不当
降低二抗浓度,缩短二抗孵育时间。
(7) 检测过程中膜干燥
任何时候都应避免干膜。
(8) 曝光过度
缩短曝光时间。
另外,NC膜的背景通常比PVDF膜的背景更干净,可以选择使用NC膜。
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