胶原蛋白医疗器械主文档登记

笑看风云

一、胶原蛋白简介

1、什么是胶原蛋白？

胶原蛋白是蛋白质的一种，我们所知蛋白质与碳水化合物、脂质一起被称为三大营养素，是构成人体的重要成分之一。形成人体的蛋白质中，约30%是胶原蛋白。
胶原蛋白是一大堆氨基酸组成的有生物学功能的大分子，主要包括甘氨酸Gly、脯氨酸Pro和羟脯氨酸Hyp这三种氨基酸，分子量约为300kDa，具有三股螺旋结构，并且都是由3条多肽链组装而成。也就是由氨基酸连接而成的3条链组合在一起。
胶原蛋白是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，某些生物体中的胶原蛋白占蛋白质总量甚至高达80%以上。
说到到胶原蛋白，我们最先联想到的就是脸部等处的皮肤需要胶原蛋白，胶原蛋白占据了这些皮肤的约70％。其实胶原蛋白不仅存在于肌肤，而是遍布全身的所有部位，在骨头和血管等地方含有大量的胶原蛋白。皮肤的胶原蛋白发挥着赋予肌肤韧性弹性，保持肌肤水润健康的作用，骨中的胶原蛋白能保持骨头内侧的柔软性，防止骨头变得脆弱易折。综上所述，胶原蛋白有着保持身体和脏器结构的作用，在体内的各个部位都发挥着重要作用。
2、胶原蛋白分类

胶原蛋白是一类蛋白质家族，已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白分子，根据其结构，可以分为纤维胶原、基膜胶原、微纤维胶原、锚定胶原、六边网状胶原、非纤维胶原、跨膜胶原等。按照胶原的来源，可以分为人源/牛源/猪源/鱼源等胶原；按照胶原的功能，可将胶原分为两组，第一组是成纤维胶原，约占胶原总数的90%，包括第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅺ、ⅩⅩⅣ和ⅩⅩⅦ型胶原；其余是第二组，非成纤维胶原。非成纤维胶原的α-链既含有三螺旋域（胶原域，COL），还含有非三螺旋域（非胶原域，NC）。目前已经鉴定初的动物胶原，一共有29种，按照发现时间的早晚，分别命名为I型～XXIX型胶原：I型胶原（成纤维胶原）、II型胶原（成纤维胶原）、III型胶原（成纤维胶原）、IV型胶原（网状结构胶原）、V型胶原（成纤维胶原）、VI型胶原（珠状细丝胶原）、VII型胶原（锚定胶原）、VIII型胶原（网状结构胶原）、IX型胶原（纤维相关胶原）、X型胶原（网状结构胶原）、XI型胶原（成纤维胶原）、XII型胶原（纤维相关胶原）、XIII型胶原（跨膜胶原）、XIV型胶原（纤维相关胶原）、XV型胶原（内皮抑制素相关胶原）、XVI型胶原（纤维相关胶原）、XVII型胶原（跨膜胶原）、XVIII型胶原（内皮抑制素相关胶原）、XIX型胶原（纤维相关胶原）、XX型胶原（纤维相关胶原）、XXI型胶原（纤维相关胶原）、XXII型胶原（纤维相关胶原）、XXIII型胶原（跨膜胶原）、XXIV型胶原（成纤维胶原）、XXV型胶原（跨膜胶原）、XXVI型胶原、XXVII型胶原（成纤维胶原）、XXVIII型胶原、XXIX型胶原（非纤维胶原）。
常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。Ⅰ型胶原蛋白主要分布于皮肤、肌腱等组织，也是水产品加工废弃物（皮、骨和鳞）含量最多的蛋白质，占全部胶原蛋白含量的80%～90%左右，在医学上的应用最为广泛。Ⅱ型胶原蛋白由软骨细胞产生；基底膜胶原蛋白通常是指Ⅳ型胶原蛋白，其主要分布于基底膜；细胞外周胶原蛋白通常中指Ⅴ型胶原蛋白，在结缔组织中大量存在。
3、胶原蛋白的营养价值

其实胶原蛋白的营养价值非常低，没有必要作为营养素摄取。但是，正如前文已经介绍过的那样，它是构建身体和脏器结构的蛋白质，体内的胶原蛋白减少后，不仅肌肤更易长皱纹和变得松弛，身体的各种组织也会变得脆弱。胶原蛋白是可以在体内生成的，因为和各种营养素相关，最重要的是时刻注意饮食均衡。特别是维生素C，更是生成胶原蛋白时不可缺少的成分。
富含胶原蛋白的食品中，常被提及的包括鱼翅、鸡翅、鳗鱼等。现在可以买到的胶原蛋白补充剂和饮料中使用的胶原蛋白大致分为2种，源自鱼的胶原蛋白，以及从牛、鸡等哺乳类中提取的胶原蛋白，不管哪种，作为胶原蛋白成分而言并没有太大的区别。
4、胶原蛋白的应用

胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。
胶原蛋白在医疗器械方面的应用：常用于医美类产品，例如胶原贴敷料和整形用注射填充物。胶原贴敷料主要用于皮肤激光术后创面修复的辅助治疗，整形用注射填充物主要用于纠正鼻唇沟纹和额部动力性皱纹。
5、胶原蛋白市场前景
据报道，2023年全球胶原蛋白市场规模达到70.7亿美元，预计到2024年底该行业收入可能达到74.4亿美元。 预计到2031年胶原蛋白行业价值将达到1085万美元，呈现复合年增长率（2024 年至 2031 年间的增长率） (CAGR) 为 5.53%。
二、胶原蛋白原料来源

胶原蛋白原料来源有两种，一是天然胶原蛋白，也就是提取自动物组织的胶原蛋白，如畜禽动物的纤维组织（筋腱、韧带、软骨和皮肤等）、海洋生物组织（鱼皮、鱼翅、鱼鳞和鱼骨等）；二是重组胶原蛋白，主要就是重组人源化胶原蛋白，重组人源化胶原蛋白是由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。
四、胶原蛋白原料主文档登记

胶原蛋白作为医疗器械产品原材料，可以进行主文档登记，用于授权医疗器械注册申请人在申报医疗器械注册等事项时引用其作为注册申报资料的一部分。
2021年3月12日国家药监局发布《关于医疗器械主文档登记事项的公告》（2021年第36号）（以下简称《公告》），以指导生产企业进行原料（原材料和关键元器件）主文档登记，方便医疗器械生产企业选择原材料和关键元器件，简化注册申报。《公告》规定主文档的登记采取自愿原则。主文档由其所有者自愿提交给监管机构进行登记，在登记时不经过实质审评，待关联医疗器械注册申请受理后一并审评。当医疗器械申请人在申报产品上市注册中需要使用主文档资料时，主文档所有者向医疗器械申请人出具授权书。医疗器械申请人将该授权书作为申报资料的一部分代替已登记的主文档资料。当监管机构对医疗器械申报资料进行审评时，可依据授权书调阅已登记的主文档资料进行审评。当不同医疗器械引用相同主文档时，可避免技术资料的重复提交及重复审评。
医疗器械主文档登记制度是为了优化和加速医疗器械审评审批程序，是平衡审评审批与供应商技术保密的重要合规流程，为了配合医疗器械注册关联审评，2021年10月1日实施的新版《医疗器械注册与备案管理办法》（47号文）明确规定：“申请人在申请医疗器械产品注册、变更注册、临床试验审批中可以经医疗器械主文档所有者授权，引用经登记的医疗器械主文档。医疗器械主文档登记相关工作程序另行规定”。
医疗器械主文档是在医疗器械注册电子申报系统（eRPS）提交登记，登记申请人或境内代理人（境外或港澳台地区申请人）申请数字认证（CA）证书后，在eRPS中提交申请资料进行登记。医疗器械主文档登记时不经过实质的技术审评，其技术评审将在授权相关医疗器械产品注册申报过程进行关联审评。医疗器械主文档内容主要涉及医疗器械原材料等，同一种材料应用于不同的医疗器械，考虑到实际临床应用，其化学表征、生物学特性等安全性评价研究要求也不同，因此在关联医疗器械注册申报过程，针对主文档登记会有相应补充研究要求。
中国医疗器械主文档（MAFs）登记制度自2021年3月12日实施以来，截止2024年10月已经完成主文档登记680多项，其中登记的主文档主要为医疗器械原材料的研究资料，如原材料组成成分描述、理化性能研究资料、生物学评价资料、毒理学风险分析资料等技术资料。医疗器械生产企业也可以通过公示的主文档登记信息寻找可替代的原材料、配件或技术研究供应商，调整医疗器械研发和注册申报策略，以低成本高效的完成产品注册申报。医疗器械主文档登记清单在国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心网站进行登记信息公示（请点击医疗器械主文档登记清单跳转）。
4.1动物源胶原蛋白主文档

动物源胶原蛋白主要提取自动物组织。动物来源的胶原，有猪源I型胶原蛋白、牛源I型胶原蛋白等，具有稳定的三螺旋结构，生物活性强，能够起到较强的支撑作用。
对于人体来说，动物源的胶原属于异体胶原蛋白，可能携带具有传染性的病原体，产生异体排斥反应。因此在注册资料中应提交关于动物源性材料病原体灭活工艺的研究资料及降低免疫源性物质的工艺研究资料。供应商可将此部分资料进行主文档登记。
医疗器械原材料（体外诊断试剂除外）的技术资料一般是指原材料组成成分描述、理化性能研究资料、生物学评价资料、毒理学风险分析资料等。具体内容可参阅主文档登记电子申报目录。
动物源胶原蛋白原料，应符合ASTM F2212—2009的要求。考虑到原料来自于动物， 会产生携带病毒的风险，应参照YY/T 0771.1、YY/T 0771.2、YY/T 0771.3进行管理。动物源胶原蛋白研究资料可参考尧其：动物来源胶原蛋白产品的临床前研究
非临床研究主要考虑一下内容：

• 理化性能研究：应当提供研究资料，包括功能性、安全性指标以及与质量控制相关的其他指标的确定依据，所采用的标准或方法、采用的原因及理论基础。动物源胶原蛋白的性能指标如下（仅供参考）：
  

1）理化特性
可研究外观、可见异物、溶解性、水分灼烧残渣、PH值、渗透压摩尔浓度、动力粘度、热稳定性、装量及其差异、熔点。
2）鉴别
可研究肽图、末端氨基酸序列、分子量、等电位。
3）纯度
可通过电泳法或高效液相色谱法进行试验。
4）杂质、污染物和添加剂
杂质检测项目可能涉及到的项目有：杂蛋白分析、外源性DNA残留量、残余抗生素含量/活性、促炎性污染物（肽聚糖等）、重金属及微量元素含量、添加剂等。
5）含量
可用总蛋白含量和纯度计算。
6）结构表征
可通过特异性分析、一级结构的表征、红外光谱、圆二色光谱、微量差热分析、蛋白酶敏感性分析、脯氨酸羟基化分析、糖基化修饰分析进行研究。
7）安全性试验
无菌、细菌内毒素、微生物限度等。

• 生物学功能：动物源胶原蛋白主要生物学功能是为细胞提供支架和良好的微环境，可通过评价细胞-胶原蛋白相互作用来评价动物源胶原蛋白的生物学功能，比如细胞增殖、细胞分化、细胞粘附性、细胞的迁移或移行。
  
• 生物学评价：应对成品中与患者和使用者直接或间接接触的材料的生物相容性进行评价，可以按照GB/T 16886.1 的要求对动物源胶原蛋白进行相应必要的生物相容性评价研究。应在材料的化学表征、毒代动力学和有关毒性风险评价的科学数据基础上进行毒理学评价。如有必要，还应该基于详细测试并获得数据后再进行毒理学评价。评价包括短期和长期的潜在影响，包括细胞毒性、刺激反应、致敏性、热原、遗传毒性、皮下植入、免疫原性、全身毒性和致癌性。生物相容性评价研究资料应当包括：
  a.生物相容性评价的依据和方法。
  b.产品所用材料的描述及与人体接触的性质。
  c.实施或豁免生物学试验的理由和论证。
  d.对于现有数据或试验结果的评价。
  
• 生物来源（人类/动物）材料的安全性评价：对于动物源性材料等具有生物安全风险的物质，应当提供相关材料及生物活性物质的生物安全性研究资料。包括说明组织、细胞和材料的获取、加工、保存、测试和处理过程；阐述来源，并描述生产过程中对病毒、其他病原体及免疫源性物质去除或灭活方法的验证试验；工艺验证的简要总结。
  
• 灭菌/消毒研究：提供适用的灭菌/消毒工艺研究资料，应明确灭菌工艺（方法和参数）和无菌保证水平（SAL），并提供灭菌确认报告。如灭菌使用的方法容易出现残留，应当明确残留物信息及采取的处理方法，并提供研究资料。
  
• 动物试验研究：提供适用的临床前动物试验研究资料。动物试验研究资料包括动物试验研究的目的、结果及记录。
  
• 货架寿命和包装验证：包装、运输和贮存：建议考虑相关医疗器械产品对原材料包装、贮存、运输的要求。
  
• 产品信息和生产信息描述：1.应当明确原材料生产加工工艺，注明关键工艺和特殊工艺，并说明其过程控制点。明确生产过程中各种加工助剂的使用情况及对杂质（如残留单体、小分子残留物等）的控制情况。2.有多个研制、生产场地，应当概述每个研制、生产场地的实际情况。
  

4.2重组胶原蛋白主文档

近年来，随着基因重组、蛋白质组学等基础理论、技术手段和临床医疗探索研究的不断发展，重组胶原蛋白日益成为重要的生物材料，为相关医疗器械的研发提供了新的思路与方法。重组人源化胶原蛋白是由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。重组人源化胶原蛋白是通过基因工程生产的蛋白，工程细胞构建过程、生产用细胞的质量控制及常规生产过程控制是该原材料生产工艺及风险评价的基础。
重组胶原蛋白主文档登记资料可参阅《重组人源化胶原蛋白原材料评价指导原则》（2023年第16号），主要内容如下：
（一） 重组人源化胶原蛋白原材料性能研究
1.鉴别
1.1氨基酸序列及覆盖度
1.1.1氨基酸组成
1.1.2氨基酸末端序列
1.2肽图
1.3分子量
1.4等电点
1.5巯基和二硫键
1.6消光系数（或克分子吸光度）
1.7电泳图型
1.8液相色谱图谱
2.结构表征
2.1脯氨酸羟基化
2.2高级结构分析
2.2.1三螺旋结构分析
可采用圆二色谱在特定常规试验条件下的检测重组人源化胶原蛋白的CD光谱特征。可采用X射线晶体学技术或冷冻电镜技术在原子结构水平考证胶原蛋白材料或其包含的特定氨基酸序列的三螺旋结构特性，计算有结构信息的序列占整个蛋白序列的百分比；可采用差示扫描量热法检测胶原蛋白材料结构变化的热效应辅助说明胶原蛋白的高级结构特征；可采用红外光谱进行结构分析，其非特征区（如：酰胺a、b）和特征区（如：酰胺I、酰胺II、酰胺III）的特征峰位置需与参比品一致；可采用拉曼光谱，其拉曼光谱图需与参比品一致；也可应用其它紫外或可见光吸收光谱法、核磁共振（NMR）等适当的方法检测。
2.2.2纤维质量/多孔网状结构表征
若材料预期形成纤维/网状结构时，宜使用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）或原子力显微镜（AFM）等方法观察胶原蛋白材料形成胶原纤维束/多孔网状结构等，需明确两种方法具体的制样和观察测定过程。与此相关的胶原分子自组装和聚合能力分析，可参考相关国内外相关标准进行研究。
3.纯度
4.含量
5.杂质、污染物和添加剂
对胶原蛋白材料工艺相关杂质以及外源污染物等进行研究，如：细胞基质来源、细胞培养来源和下游工艺。需对潜在的工艺相关杂质（如宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、细胞培养残留物、下游工艺的残留物等）进行鉴别、评估，并进行定性和/或定量分析，并采用适宜的方法评价其对生物学功能的影响。工艺相关杂质来源于生产工艺，可分三大类：来源于细胞基质、培养基和下游工艺。细菌内毒素、微生物限度和无菌性，是常规的污染物控制要求。
5.1源于细胞基质的杂质
来源于细胞基质的杂质包括源于宿主生物体的蛋白/多肽；核酸（宿主细胞/载体/总DNA）；多糖及病毒。对于宿主细胞蛋白，一般需用能检测出较宽范围蛋白杂质的灵敏的免疫检测方法。
5.1.1外源性DNA残留量
按照《中华人民共和国药典》“外源性DNA残留量测定法”的“荧光染色法”或“定量PCR法”进行测定，“荧光染色法”的样品加标回收率需满足70%～130%；“定量PCR法”的样品加标回收率需满足50%～150%，需规定残留限量。如果样品中外源性DNA残留量低于“荧光染色法”的检测限，则需采用“定量PCR法”进行测定。
5.1.2宿主细胞蛋白质残留量
5.1.2.1大肠杆菌蛋白质残留量：按照《中华人民共和国药典》“大肠埃希菌菌体蛋白质残留量测定法”或采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定。
5.1.2.2酵母蛋白质残留量：按照《中华人民共和国药典》“酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法”或采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定。
5.1.2.3CHO细胞蛋白质残留量：采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定。
5.1.3促炎性污染物（肽聚糖）：采用经验证的方法或经验证的市售细菌肽聚糖检测试剂盒（ELISA）检测残留肽聚糖，需根据其致热反应风险规定可接受的限量要求。
5.1.4碳水化合物结构：根据细胞基质等因素，必要时需考虑测定糖蛋白中碳水化合物的含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。
5.2源于培养基的杂质
来源于培养基的杂质包括诱导剂（多核苷酸，病毒）、抗生素、血清及其他培养基组分。需根据工艺中采用的表达体系和使用的抗生素类型，采用经验证的方法测定残余抗生素含量/活性，残余抗生素含量需符合《重组人源化胶原蛋白》行业标准等相关标准，不应有残余抗生素活性。
残余抗生素含量的测定按照YY/T 1849《重组胶原蛋白》中描述的方法或其他经验证的方法进行检测，残余抗生素活性按照《中华人民共和国药典》 四部通则 生物活性测定法中抗生素微生物检定法或《中华人民共和国药典》 四部通则 抗生素残留量检查法进行检测。
5.3源于下游工艺产生的杂质
5.3.1添加剂：如果使用了防腐剂、冻干保护剂等添加剂，需给出其限量要求和检测方法。
5.3.2重金属及微量元素含量需符合以下规定。
5.3.2.1重金属元素：对工艺中添加的重金属元素，需符合规定限值。
5.3.2.2重金属含量：重金属总量（以Pb计）需符合YY/T 1888《重组人源化胶原蛋白》行业标准等相关标准中的限值。
5.3.2.3微量元素含量：微量元素含量：砷（As）、汞（Hg）、铅（Pb）、铬（Cr）、镉（Cd）、铜（Cu）、钼（Mo）、铁（Fe）、镍（Ni）需符合YY/T 1888《重组人源化胶原蛋白》等相关标准中的要求。
5.4细菌内毒素：细菌内毒素相关限量要求需考虑医疗器械终产品与人体的接触方式。
5.5微生物限度：若重组人源化胶原蛋白材料以微生物限度控制状态提供，按照《中华人民共和国药典》 四部通则 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法和非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法进行检测，结果需符合相关要求。
5.6无菌：若重组人源化胶原蛋白材料以无菌状态提供，按照《中华人民共和国药典》 四部通则 无菌检查法进行检测，结果需无菌。
5.7分子变异体
5.7.1化学修饰类型
各种非预期的翻译后修饰是导致重组蛋白异质性的重要质量问题，如：脱酰胺化、氧化、糖谱/糖基化修饰等和其他可能的N端、C端修饰（如乙酰化、酰胺化或者由于外肽酶导致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等），以及各种其他异质性（如异构化、碎片化、二硫键错配、N-连接和O-连接的寡糖、聚集等）。适用时，需按YY/T 1849《重组胶原蛋白》中的要求，参照《重组胶原蛋白肽图指纹图谱分析》行业标准等相关标准进行分析。需考虑脱酰胺、异构化、错配二硫键连接和氧化形式的分离和鉴别。对这些变异体的分离和鉴别，可采用层析法、电泳法（如毛细管电泳）、质谱法和/或光谱法（如圆二色谱）。
5.7.2降解物和聚合体
降解物和聚合体：聚合体包括二聚体和多聚体，可用分子筛层析法（如SE-HPLC）进行定量；需建立成品中非预期降解物的判定标准，并对稳定性试验产生的降解产物进行监测。
6.热稳定性
如果重组人源化胶原蛋白是多聚体，可采用差示扫描量热分析（DSC）进行解聚温度分析。可参考《中华人民共和国药典》 四部。
如果是单链的蛋白肽，可参考《中华人民共和国药典》 四部，人免疫球蛋白3.3.2.4热稳定性试验，将供试品置（57±0.5）℃水浴中保温4h后，用可见异物检查装置，肉眼观察需无凝胶化或絮状物。
7.其它理化指标
胶原蛋白材料其它性能指标宜根据医疗器械终产品特性及相关通用要求制定，在适用时，需对相关性能指标检测方法使用的参比品进行性能研究，对照品技术参数需明确且性能稳定。用于理化测定等方面的参比品，需进行必要的分析鉴定，包括但不限于：
7.1外观（如性状、颜色）
用肉眼直接观测，需为白色/淡黄色/无色透明液体或凝胶，或白色/类白色冻干粉或海绵状固体。
7.2可见异物
按照《中华人民共和国药典》 四部通则 可见异物检查法第一法（灯检法）进行检测，需无明显异物。
7.3溶解性
需根据供试品的溶解特性，对供试品在水、稀酸或中性盐溶液中的溶解程度进行表征和阐述。
7.4水分
适用时（如冻干样品），需明确水分含量。除另有规定外，取供试品约1g～2g，按照《中华人民共和国药典》“水分测定法”第二法（烘干法）测定，或取供试品约10mg按照《中华人民共和国药典》“热分析法”热重法（TG）测定，升温程序：从室温以10℃/min速率升温至105℃，保持60min。减失重量需符合所标示范围。规定仲裁方法为水分测定法。
7.5炽灼残渣
除另有规定外，取1.0-2.0g，按照《中华人民共和国药典》 四部通则 炽灼残渣检查法进行检测。
7.6酸碱度
液体和凝胶样品直接取样，固体样品用生理盐水稀释为1mg/mL，按照《中华人民共和国药典》 四部通则“pH值测定法”进行检测，需符合所标示值的±1.0。
7.7渗透压摩尔浓度
适用时，液体和凝胶样品直接取样，固体样品用生理盐水稀释为1mg/mL按照《中华人民共和国药典》 四部通则 渗透压摩尔浓度测定法进行检测，渗透压摩尔浓度范围需符合相关标准要求。
7.8动力黏度（凝胶）
取供试品按照《中华人民共和国药典》“黏度测定法”的“旋转黏度计测定法”测定，需要详细描述试验条件，动力黏度值需符合所标示范围。
7.9装量及差异
根据供试品性状（溶液、凝胶、冻干海绵或冻干粉末等）和装量的不同确定装量的允差要求。例如：20g（mL）以下，单个装量不低于标示装量的93%；20g（mL）至50g（mL），单个装量不低于标示装量的95%；50g（mL）以上，单个装量不低于标示装量的97%；平均装量不低于标示装量。
8.降解特性及产物
需对胶原蛋白材料降解特性进行研究，可采用凝胶渗透色谱（GPC）测定降解产物的分子量分布及分子量，水解/酶解产物可使用氨基酸分析仪、高效液相色谱或其他适宜的方法测定。
9.生物学功能评价
重组胶原蛋白的生物学功能是指以重组胶原蛋白生物学特性相关属性为基础的生物学作用，对声称的生物学功能宜进行定性定量分析。胶原是细胞外基质的主要成分，重组人源化胶原蛋白作为重组胶原蛋白的一种，其主要生物学功能也同样是为细胞提供支架和良好的微环境，如促进细胞黏附、增殖、生长、分化等。因此，可通过评价细胞-胶原蛋白相互作用来评价重组人源化胶原蛋白的生物学功能。细胞增殖、分化、黏附性、迁移或移行评价方法可参考YY/T 1849《重组胶原蛋白》。
由于胶原类材料在分子组成、微结构、物理性能方面可能差异显著，需检测材料与细胞之间相互作用及其引导细胞基础响应的性能。细胞响应的参数包括细胞形态、面积和体积，均可通过二维（2D）或三维（3D）图像技术可视化评价，还包括存活率、增殖率、程序化凋亡以及迁移。
鼓励对重组人源化胶原蛋白对细胞的作用机理进行研究。例如，抗体阻断试验可用来确定细胞表面的何种受体参与了与胶原的作用，如整合素或盘状结构域受体（DDRs）。此外，细胞骨架成分（如肌动蛋白）的协同作用也可用来评价细胞与基质间的粘附与收缩解离。有多种在单细胞或多细胞水平上评价细胞引导的收缩解离的方法，包括自由漂浮组织构建物的尺寸随时间的变化、施加在培养-力学监测系统上力的大小，以及单个细胞在胶原网络的应力和形变等。
其它适用于干细胞和祖细胞类型的细胞-胶原相互作用的功能性检测包括细胞株的定向分化，特定干细胞或祖细胞的增殖，或组织形态发生（始于内皮祖细胞的血管形成）。按照《中华人民共和国药典》 四部 进行成纤维细胞生长因子生物学活性测定，对胶原蛋白肽-细胞相互作用评价，反映胶原蛋白肽与成纤维细胞增殖的构效关系。
按照《中华人民共和国药典》 四部 生物活性测定法对试验结果进行统计学分析，包括对验证指标结果的绘图和统计学分析，以及判断其是否符合可接受标准等。常规的统计学方法一般要求数据之间相互独立，并呈近似正态分布和方差齐性，通常采用相对效价的对数转换值进行数据分析。当无法满足上述统计学要求时，也可考虑采用其他适宜的替代方法进行数据分析。
上述关于胶原—细胞相互作用的功能性测定也可作为医疗器械产品标准化和质量控制的方法。三维支架材料中细胞活性评价方法可参考YY/T 1562《组织工程医疗器械产品 生物材料支架 细胞活性试验指南》。
（二） 材料免疫学安全性研究
临床前安全性评价包括临床前安全性试验，其目的主要是确定新胶原蛋白材料是否会在人体引起未能预料的不良反应，免疫学安全性研究是重组人源化胶原蛋白材料生物安全性研究资料的主体。但是，用传统生物试验方法来评价重组人源化胶原蛋白往往有困难，并受多种因素的影响。例如高度的种属特异性，人的蛋白质对人的生物学活性远高于对动物的活性，而且人的蛋白质氨基酸序列，常常与来自其它种系的蛋白质不同，例如糖基。因而由基因工程技术所制备的蛋白质或肽类往往会在人体以外的其它宿主中产生免疫应答，其生物学效应有所改变，并可能因形成免疫复合物而导致有毒性反应，而这样产生的毒性反应与人体安全性显然无关。
另外，由于重组人源化胶原蛋白功能、生产工艺或者胶原蛋白材料稳定性等要求，对胶原蛋白材料进行修饰或者改构，需提供与未修饰或者改构材料比较的研究资料。以简化生产工艺为目的而引入的额外多肽片段如His-tag，在最终的材料成品中需符合相关行业标准的要求。
1.免疫原及免疫化学检验
基于部分人胶原蛋白核酸序列进行编辑组合而重组的蛋白质产物，特别是长期反复使用时，可能引起人体预测不到的免疫原性。因此，不能完全排除其免疫原性风险，宜增加免疫学研究。重组人源化胶原蛋白作为医疗器械用原材料，可采用适宜方法进行免疫学评价。若用动物进行免疫学试验，可能因为动物模型与临床应用之间存在种属差异，带来对评价试验结果或评价试验数据使用上的局限，需要根据临床评价获得的免疫学评价数据及动物模型获得的免疫评价数据进行综合评价分析。
患者对蛋白质类材料产生免疫应答的风险将随医疗器械产品变化而变化。建议采用基于风险的方法来评价和减轻与影响人源化胶原蛋白安全性和有效性相关的免疫应答。人源化胶原免疫原主要源自生产过程中残留的可致免疫原性的各种因子，包括残留的各种杂蛋白（包括DNA转录过程中可能产生的异种蛋白）、残留的大肠杆菌及酵母菌外源性DNA、材料致热原、生产过程中菌体产生的细菌内毒素、DAMPs以及人源胶原特异性免疫等等。
为降低人源化胶原蛋白材料的免疫原性风险，一般需在材料设计及生产工艺中采取相应处理措施以降低其免疫原性，如宿主细胞选择，蛋白提取、蛋白纯化。注册申请人需对其降低材料免疫原性的有效性进行验证，并提供验证试验性数据或相关研究资料。注册申请人需提供免疫原性检测范例的理论依据，需使用经完全验证的检测法对来自关键性研究的样品进行检测，并提供支持该检测法的全面验证的数据。
杂蛋白的检测可参考YY/T 1453《组织工程医疗器械产品 I型胶原蛋白表征方法》，外源性DNA检测可参考YY/T 0606.25《组织工程医疗产品 第25部分 动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法》。胶原蛋白材料的免疫原检验可通过流式细胞术（FCM）或酶联免疫吸附法（ELISA）测定，检测试验宜考虑，但不限于淋巴细胞增殖试验（YY/T 0606.15《组织工程医疗产品 第15部分 评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验》）、细胞迁移试验（YY/T 0606.20《组织工程医疗产品 第20部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：细胞迁移试验》），采用非标方法时需进行方法学验证。
免疫原性检测可设计为检测不期望的生物或生理结果的抗体，重组人源化胶原蛋白抗体可能降低效果或者引起过敏等反应。抗体检测的免疫原试验可参考《中华人民共和国药典》，选择适宜的方法进行，包括桥联或均相酶免疫法、放射免疫沉淀试验等，并进行相关的方法开发和试验验证。试验过程中，可根据滴度试验和中和活性试验进一步对ADA进行分析，还可进行额外的抗体特征分析，包括抗体分型、抗原表位鉴定及交叉反应评价。
筛选检测法（也称为结合抗体（BAb）检测法）用于检测与材料结合的所有抗体。使用确证性检测法建立BAb对材料的特异性，使用滴定和中和检测法进一步表征重组人源化胶原蛋白抗体。使用滴定检测法表征抗体应答的量级，抗体对安全性和有效性的影响可能与其滴度和持续性而不是发生率相关。中和检测法评估抗体干扰材料-靶标相互作用的能力。中和抗体（NAb）是BAb的亚类，ADA对安全性和有效性的影响可能与NAb活性而不是抗体发生率相关。类似地，在一些情况下可能重要的是确定NAb滴度。用于检测抗体的首选检测法应当是检测低亲和力和高亲和力抗体的高灵敏度筛选检测法。注册申请人在开发检测方法以确认重组人源化胶原蛋白特异性抗体结合时，需选择合适的确证性检测法以防止抗体假阳性数据，这些假阳性数据会混淆抗体对安全性和有效性影响的分析。
注册申请人需提供支持该检测法的全面验证的数据。验证包括证明用于给定样品中抗体的定量测量的特定检测法对于预期用途是可靠和可重现的。抗体检测法有助于评价材料的免疫原性，然而抗体的检测依赖于检测法的关键操作参数（如灵敏度、专属性），一般来说，建议注册申请人开发针对灵敏度、专属性、选择性、精确度、重复性和稳定性进行优化后的检测法。
其他的免疫原评价及生物学性能及生物相容性评价等建议做医疗器械终产品的检测，因为加工工艺不同最终产品性能不同，例如有些交联工艺可能会封闭某些免疫原反应簇等等。
2.免疫毒理学评价
当拟生产医疗器械免疫原性风险与已上市产品无可比性，且无充分的文献数据评价其免疫原性，需进行免疫毒理学试验研究。通过免疫毒理学试验，对炎症反应、免疫抑制、免疫刺激、超敏反应以及自身免疫进行确证评价，评估免疫系统改变导致的潜在人体不良健康作用。
免疫毒理学可通过流式细胞术（FCM）、酶联免疫吸附法（ELISA）、组织病理切片等方法测定，试验方法可考虑结合生物学试验、体外T淋巴细胞转化试验（YY/T 1465.1《医疗器械免疫原性评价方法 第1部分 体外T淋巴细胞转化试验》）等，注册申请人需对选用检测方法的适用性进行评价，采用非标方法时需进行方法学验证。
可参考GB/T 16886.20《医疗器械免疫毒理学试验原则和方法》选择性进行功能性或非功能性免疫毒理学试验，通过啮齿动物试验方式检测和评价物质的不良作用。目前主要研究方法是将医疗器械/材料植入小鼠/模式小鼠，然后研究器械/材料整个降解周期内机体的体液和细胞的免疫应答，以及局部组织的免疫反应。功能性检测测定细胞和/或器官活性，例如淋巴细胞对有丝分裂原或特异性抗原的增殖反应、细胞毒性和特异性抗体的形成；非功能性检测涵盖形态学方面和/或定量的术语、淋巴组织变化程度、淋巴细胞数目和免疫球蛋白水平或其他免疫功能标志物。
（三） 材料生物学风险评价
作为制备医疗器械产品的原材料，需参照GB/T 16886.1的要求对重组人源化胶原蛋白原材料进行必要的生物学评价，尤其通过胶原蛋白材料到医疗器械终产品的加工工艺分析发现，两者之间的生物学风险相近时。如预期用于植入产品的原材料，还需评估样品是否为内源性凝血系统激活物。若医疗器械终产品与胶原蛋白材料的使用方法不一致，需考虑生物学补充研究。
根据GB/T 42062《医疗器械 风险管理对医疗器械的应用》描述的风险管理过程进行生物学风险评定，识别材料、添加剂、加工助剂和其他潜在可沥滤物中的危害，接触剂量等因素，绘制基于风险管理的生物学评价流程图。
如果医疗器械产品以非灭菌的方式提供，可将样品灭菌后用于生物学评价试验，需考虑灭菌方式及灭菌对重组人源化胶原蛋白的影响。
可能需要评价的生物学风险评定终点包括但不限于：细胞毒性、致敏性、皮肤刺激性、皮内反应、材料介导的致热性、全身毒性、溶血性、植入反应、遗传毒性。
（四） 稳定性研究与直接接触性容器/材料研究
1.稳定性研究
重组人源化胶原蛋白生产过程中间体如涉及到贮存，则需开展相应的稳定性研究。采用拟贮存阶段样品的代表性批次开展研究，一般包括贮存、运输（如适用）和使用稳定性研究等。研究开展前，需统筹制定稳定性研究方案，关注各稳定性研究所用样品、直接接触性容器/材料、检测时间点、检测条件和分析检项等。
研究中需对能够反映质量变化的敏感特征进行研究，如含量、完整性、纯度、微生物安全性和生物学特性等。需依据相应的医疗器械产品的贮存运输条件开展研究，涵盖设定的各项条件，如温度、光照、反复冻融（冷冻贮存时）、振摇等方面。根据实际使用情况，开展使用中的稳定性研究，例如复溶或解冻、与复溶稀释剂的相容性研究等。研究中需采用与实际使用相同材质的直接接触性容器/材料。
2.直接接触性容器/材料研究
如涉及贮存，需对直接接触的包装容器开展相应的包材相容性研究。根据相容性研究结果，结合稳定性研究，选择合理的包装容器。
另外，对制备工艺中与样品接触的容器和一次性使用材料（如贮存袋、过滤膜、层析介质、管路等），需开展风险评估和/或相应的相容性研究。

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