如何解读 elisa 检测方法？

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如何解读 elisa 检测方法？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/596657657

大力水手

ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附测定）是一种基于抗原-抗体特异性结合的免疫学检测技术，利用酶标记的抗体或抗原，通过酶催化的显色反应检测目标分子（如蛋白质、抗体、激素等）的存在和含量。
基本原理：
1、抗原-抗体特异性结合：利用抗体识别特定抗原，或抗原结合特定抗体。可以分为直接法、间接法、夹心法、竞争法；
2、酶标记和显色反应：结合特定酶（如辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP），通过底物反应产生可检测的颜色变化；
3、定量分析：通过比色法测定光吸收值，与标准曲线比较，计算待测物的浓度。
检测激素的ELISA试剂盒类型

检测原理	适用激素类型	激素名字
双抗体夹心法	大分子肽类/蛋白质激素	Insulin（胰岛素）、GH（生长激素）、TSH（促甲状腺素）、FSH（促卵泡素）、LH（促黄体生成素）
竞争法	小分子激素（类固醇）	T（睾酮）、E2（雌二醇）、PROG（孕酮）、MT（褪黑素）、 PGF2α（前列腺素）

样本处理：
血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或 4℃过夜，然后 1000×g离心 20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
血浆：用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于 2-8℃1000×g离心 15 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃℃保存，但应避免反复冻融。
组织匀浆：用预冷的 PBS （0.01M,pH=7.4）冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织碎。将碎的组织与对应体积的 PBS（一般按 1：9 的重量体积比，比如 1g 的组织样品对应 9mL 的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于 5000×g离心 5~10 分钟，取上清检测。
细胞裂解液：贴壁细胞用预冷 PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g 离心 5 分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用预冷PBS 清洗 3 次，每 1×10^6 个细胞中加入 150-200uL PBS 重悬（推荐在PBS 中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可适当减少 PBS 体积）并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于 2-8℃，1500×g 离心 10 分钟，取上清检测。
细胞培养上清：请 1000×g离心 20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
其它生物液体：1000xg离心 20分钟，取上清即可检测。
ELISA试剂盒特点：
1、可测样本类型多：血清、血浆、组织、细胞培养上清等样本；
2、高准确度：回收率普遍在90%-115%之间；
3、高灵敏度：灵敏度达pg级别，R2大于99。
产品推荐清单

货号	名称	样本类型	规格
abs551029	Human FSH ELISA Kit	细胞上清液，血清，血浆	96T
abs551134	Human GC ELISA Kit	细胞上清液，血清，血浆，组织匀浆，尿液，唾液，其他生物样品	96T
abs551009	Human Growth Hormone ELISA Kit	细胞上清液，血清，血浆	96T
abs551113	Human Leptin ELISA Kit	细胞上清液，血清，血浆	96T
abs551028	Human LH ELISA Kit	细胞上清液，血清，血浆	96T
abs551031	Human TPO ELISA Kit	细胞上清液，血清，血浆	96T
abs552209	Mouse Leptin ELISA Kit	细胞上清液，血清，血浆	96T
abs553008	Rat LH ELISA Kit	血清，血浆，组织匀浆，细胞培养上清，尿液，唾液，其他生物液体	96T
abs554114	Monkey INS ELISA Kit	细胞上清液，血清，血浆，组织匀浆，细胞裂解液，其他生物样品	96T
abs554111	PROG ELISA Kit	细胞上清液，血清，血浆，组织匀浆，其他生物样品	96T
abs554113	E2 ELISA Kit	细胞上清液，血清，血浆，组织匀浆，其他生物样品	96T
abs554112	T ELISA Kit	细胞上清液，血清，血浆，组织匀浆，其他生物样品	96T
abs554160	PGF2α ELISA Kit	血清、血浆 和 其他生物液体	96T

检验医师

ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA) 即酶联免疫吸附实验，是目前广泛应用于各种抗原抗体检测的方法，主要有灵敏度高和特异性强的特点。ELISA操作步骤看似简单，整个测定过程中却有诸多影响因素，导致检测结果可能与实际结果偏差较大。最常出现的问题包括显色淡，灵敏度偏低、重复性不佳等。
为帮助大家分析实验中常见问题，我们将ELISA实验中常见问题和解决方案归纳总结如下，供临床检测中参考。

常见问题1：显色淡，灵敏度偏低，阳性对照值偏低

序号	可能原因	解决方案
1	试剂盒未平衡至室温	实验前试剂盒应置于室温平衡至少30分钟，以确保所有试剂均已平衡至室温
2	温育温度不足37℃	应注意培养箱温度，放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定
3	温育时间不够	校正定时钟准确定时
4	样品或酶结合物加样量偏少	校准移液器；注意使枪头与移液器接合紧密，移液时不宜过快，排放完全
5	洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加，底物作用时间不够	严格按照说明书操作
6	样品用NaN3防腐剂，抑制了酶的活性	与酶一同加入的样品中不能用NaN3防腐
7	蒸馏水被污染、水质有问题	使用新鲜合格的蒸馏水
8	洗液配制不当	准确稀释浓缩洗涤液
9	试剂盒在运输途中时间太长	夏天长途运输时应放足够冰袋并尽可能缩短运输时间
10	试剂盒超过有效期	过期试剂不可以使用
11	不同批号试剂混用	不同批号试剂不能混用

常见问题2：高背景，阴性对照值偏高，假阳性

序号	可能原因	解决方案
1	阴性对照被阳性对照或样品污染	洗涤时勿将洗液溢出孔外
2	温育时间过长，导致非特异性结合	校正定时钟准确定时
3	加样量过多	严格按照说明书操作，加液量、稀释要准确
4	温育温度过高	应注意培养箱温度是否正确、恒定
5	加显色剂后在温育时受强光或紫外线照射	应保存在暗处，避光
6	读板前停留时间过长	加终止液后10分钟内测定结果

常见问题3：重复性差，两个复孔值相差太大

序号	可能原因	解决方案
1	样品数量多少不一，加样时间有长有短	重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近
2	保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致	重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性
3	加样量不一致	样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴
4	不同批号试剂盒组分混用	不同批号试剂不能混用

常见问题4：满板白，阳性对照不显色

序号	可能原因	解决方案
1	把终止液误当作酶结合物或底物使用	严格按说明书操作，加液时看准标签，换用合格的蒸馏水或去离子水，选用洁净量筒，正确稀释洗涤液，不要漏加试剂
2	漏加或错加试剂，如酶结合物、底物A、B液
3	蒸馏水、配制洗涤液的量筒或盛洗涤液的瓶子受酶抑制物污染

常见问题5：满板显色

序号	可能原因	解决方案
1	读板前停留时间过长	加终止液后10分钟内测定结果
2	加显色剂后在温育时受强光或紫外线照射	应保存在暗处，避光
3	温育时间过长，导致非特异性结合	校正定时钟准确定时
4	温育温度过高	应注意培养箱温度是否正确、恒定
5	加样量过多	严格按照说明书操作，加液量、稀释要准确
6	样品放置时间过长，样品染菌	样品可长期保存于-20℃，防止污染
7	洗涤不充分，反应孔中有酶残留	应充分洗涤
8	蒸馏水被污染	使用新鲜合格的蒸馏水
9	温育时未贴封板膜，使样品或酶标试剂蒸发，吸附于孔壁难以清洗	温育时应贴封板膜或加盖

优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。一些细节操作不当就会对试验结果造成很大偏差，因此我们在实验中应注意以下事项：
1. 加样：
不规范的移液操作可能带来0.1％到5％的移液误差，甚至更高！
（1）移液器定期校准：选择密封性好质量可靠的吸头，吸量不准确，直接影响检测结果；
（2）加样前，溶液充分混匀，垂直悬空加入液体，避免加在孔壁上或产生气泡；
（3）加样时避免液体溅出，如有样本溅出，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录；
（4）如果移液器漏气致使加样量不足，可先吸出（尽量吸净）后加入需求量，并做好相应记录，若结果在灰区，需要复核检测；
（5）每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。
2. 试剂盒使用前室温平衡：
温度是ELISA结合反应的重要影响因素，为使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有的试剂平衡至室温，包括检测样本，避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。
3. 标准品的溶解与稀释，严格按说明书要求进行。
ELISA标准曲线是结果计算的尺子，标准品是ELISA实验成功与否的关键点。
（1）标准品短暂离心，让因运输沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。
（2）根据说明书加入一定体积的蒸馏水（或说明书指定溶液），加水后轻柔涡旋震荡，室温静置混匀。
4. 标准品和样本做复孔
为了获得更准确的实验结果，标准品和样本进行复孔检测。
（1）计算平均值，确保实验结果更准确。
（2）解决实验中失误操作造成的跳孔现象。
（3）计算CV值，对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。
5. 温育
(1) 温育时，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。
(2) 根据说明书进行温育，并注意避光需求。在进行室温反应时，若环境温度与规定条件偏差较大，可使用恒温培养箱进行有效温育。
6. 洗涤
（1）手工洗板，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛致使液体返溅；
（2）机器洗板应经常检查冲洗头是否畅通，若被异物堵塞可用纤细针头挑出。并注意维护保养，每天使用后用纯化水或去离子水冲洗管路，保持管路洁净。
（3）洗涤后反应板尽量扣干；扣干使用的吸水材料应为无尘材质，避免污染反应孔；扣干后的反应板立即加液，不能干板太久影响反应。
7. 检测
（1）酶标仪使用前务必预热10~15分钟，使结果更稳定。
（2）长时间高湿度容易损坏酶标仪滤光片，长时间不用酶标仪时，需要定期开机维护，以保证设备性能正常。酶标仪每年均需定期校验，保证测定结果准确。
（3）根据说明书要求在规定波长条件下使用酶标仪进行结果读取。有些说明书规定双波长测定，该方法可以最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。
（4）TMB是ELISA检测中常用的底物，经HRP作用后显蓝色，经酸终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。
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ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用于检测和量化蛋白质、激素、抗体和其他分子的实验方法。下面我们从基本原理、结果判定以及注意事项三个方面对ELISA法进行解读：
1.基本原理：
ELISA依赖于抗原-抗体的特异性结合。通常，一个已知的抗体或抗原会固定在微孔板上，然后添加待测样品。如果待测样品中含有对应的抗体或抗原，它们会与固定的分子结合。接着添加与待测物有亲和力的、标记有酶的二抗。最后，加入酶的底物，发生颜色反应。根据颜色深浅或发光强度，可以定量或定性地测定待测物的浓度。
2.结果判定：
定性ELISA：简单地确定样品中是否存在目标分子。如果存在颜色反应，说明待测物存在。
定量ELISA：通过构建标准曲线来定量待测物。首先使用已知浓度的标准物质进行ELISA，得到一系列颜色反应。然后根据这些数据点绘制标准曲线。待测样品的浓度可以通过其颜色强度与标准曲线对比得到。
3.注意事项：
操作要规范，以减少交叉污染和误差。
确保所有试剂和设备均处于良好状态。
标准曲线的构建和测定要精确，以保证待测样品的浓度准确。

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酶联免疫吸附测定 (ELISA) 是一种免疫学技术，用于检测和测量特定蛋白质，如生物样品中的抗体、抗原和激素等。




如下图所示：我们将从以下两个方面对试剂盒进行研究：





首先我们从ELISA试剂盒的产品组成去了解试剂盒：在科研实验中一般采用试剂盒进行测定。ELISA试剂中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。详情如下图：




然后我们从ELISA试剂盒的性能方面去了解：
1、检测范围：
建立线性范围：需测定9-11个浓度水平，每个浓度水平重复测定3-4次。
验证标称线性参数：需测定4-6个浓度水平，每个浓度水平重复测定3-4次。
所有样本应在一次运行中或几次间隔很短的运行中随机测定，最好在一天之内完成。
2、灵敏度：
示例：人 IL-13 的最低可检测浓度为 0.1 pg/ml (6 次独立实验的平均值)。 10 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两倍 SD，计算最低可检测浓度。
注意：灵敏度跟检测范围最低点不相等。
3、稳定性（重复性、精密性）：
酶标板内精密度 3 个已知浓度的样本酶标板内重复测定 20 次，评估酶标板内的精密度。酶标板间精密度 3 个已知浓度的样本酶标板间重复检测 6 次，评估酶标板间的精密度。 试剂盒一般板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% （统计学概念） 所有样本应在一次运行中或几次间隔很短的运行中随机测定，最好在一天之内完成。 批内精密度：是众多种类精密度中最基本的一个，它是在严格的相似条件下，所得到的最佳的精密度。 批间精密度：指在同一实验室，由同一（组）操作员在同一仪器上，使用同一方法和同种、同一批号试剂，在一段时间内(一般为一个月或20个工作日)对同一测试样品（常用质控品）测量结果的精密度。 我们的试剂盒控制板内，批内CV值在10%内，批间CV值在15%内。
4、准确度（回收率）：
示例：5 份健康人血清中加入 3 个不同浓度水平的人 IL-13，未加人 IL-13 的血清作为本底，计算回收率。回收率的范围从 82 %至 110 %，平均回收率为 98 %。
现在我们了解了产品的组成，那让我们来看看实验中所需要的仪器和设备吧！

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ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
        由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
1. 直接 ELISA
直接ELISA是所有ELISA中步骤最简单的一种，方法为将抗原按一定的比例用包被缓冲液稀释好包被到固相载体上，包被完成后简单洗涤，再加入封闭液，封闭结束后再次洗涤除去多余封闭液，加入稀释好的特异性的酶标抗体，37℃温育1h或4℃温育过夜后，洗涤除去多余的抗体，加入底物显色并判读结果。最后显色的深浅与加入的酶标抗体量成正比。

2. 间接 ELISA
间接 ELISA 的步骤与直接 ELISA 步骤前面的部分基本一致，不同的是，间接 ELISA 中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体，而是非酶标的（一抗），另外再引入经过酶标的二抗与一抗特异性结合。最后加入底物显色并判读结果。

3. 夹心 ELISA
    3.1 直接夹心 ELISA
直接夹心ELISA又分为双抗体夹心ELISA和双抗原夹心ELISA。
双抗体夹心ELISA的方法是：将第一种抗体（捕获抗体）包被在固相载体上，封闭后加入待检抗原，温育后加入第二种抗体（检测抗体），捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种单抗，也可以是针对同一抗原的一种单抗与一种多抗，但是检测抗体需要经过酶标。
双抗原夹心ELISA的原理和操作与双抗夹心基本相同，不同的是用于捕获和检测的是抗原，待检对象是抗体。
    3.2 间接夹心 ELISA
间接夹心ELISA是基于两种不同种属来源的抗体的夹心ELISA，其原理是将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上（作为捕获抗体），封闭，加入待检抗原，温育，洗涤后加入另一种种属来源的特异性抗体（非酶标，作为检测抗体），最后加入酶标二抗（特异性识别检测抗体），再加底物显色。

4. 竞争抑制 ELISA
竞争抑制ELISA又称封闭ELISA，其主要原理是用待检抗原或抗体去干扰已经预先设计好的体系，最终显色的结果与待检抗原或抗体的干扰程度成负相关。大致分为直接竞争抑制ELISA、间接竞争抑制ELISA、夹心竞争ELISA等特殊的ELISA方法。
    4.1 直接竞争抑制ELISA
直接竞争抑制 ELISA 中，预先将抗原包被在固相载体上，并加入酶标的特异性抗体。实验时，加入待检抗原（或抗体），如果待检对象是抗原，则待检抗原就与预先包被在固相载体上的抗原竞争结构酶标抗体；如果待检测对象是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。洗涤过程就可以洗掉被竞争下的酶标抗体，最后加底物显色。最终显色的结果与待检原（或抗体）量成反比。
    4.2 间接竞争抑制ELISA
间接竞争抑制ELISA中，将抗原包被于固相载体上，依次加入特异性的抗体以及此抗体对应的酶标二抗作为预制备的体系。实验时，加入稀释好的待检抗原（或抗体），待检标本中的抗原（或抗体）就和预制备体系中固相载体上结合的抗原（或抗体）竞争结合特异性的抗体（或固相载体上结合的抗原）。