手把手教你拟合时间分辨荧光谱（包含仪器响应）

HaHa

时间分辨荧光光谱（TRPL）测量是分析材料性质的重要手段。在处理TRPL时，有时需要考虑仪器响应函数的影响，这时拟合步骤就变得较为复杂。本文将逐步讲解包含仪器响应的时间分辨拟合步骤。
原材料：Origin，TRPL测量数据，仪器响应函数（IRF）
我们在后续部分解决仪器响应函数如何得到的问题。首先我们将样品的TRPL测量数据导入Origin，得到如下的数据表和数据图：



图1 TRPL测量数据

一、不考虑仪器响应函数的简单拟合

如果荧光的寿命较长，或者要求不太严格，可以按照下面的步骤直接拟合：1. 点击工具栏中的数据选择工具，2. 选中一段下降过程，3. 快捷键Ctrl+Y打开拟合窗口，选择单指数衰减函数ExpDec1，拟合。拟合结果在文章末尾统一展示。



图2 简单拟合过程

二、仪器响应函数及测量

如果荧光寿命较短，已经接近测量仪器的时间分辨率，我们就需要考虑仪器响应函数（IRF）带来的影响。关于仪器响应函数的解释，这里请AI代劳：

IRF反映了整个TRPL系统（激发、探测与信号采集）对理想瞬时脉冲信号的“模糊化”效应。即使样品发光是瞬时的（如δ函数），测量系统的时间特性会将其展宽为有限宽度的信号。IRF的主要来源包括：
激发光源的时间特性：激光脉冲的有限宽度（如飞秒激光的脉宽为~100 fs）。
探测链的响应限制：探测器及电子学系统的时间延迟与抖动。
光学路径的非理想性：如光学元件的色散、多路径反射等。

最终的IRF表现为各组成部分响应函数的卷积，其时间尺度大致在几百皮秒到几纳秒的范围内。
为了在系统中获得IRF，最简单的做法是将原先的待测样品替换为平整的反射镜或者硅片，然后将激光的反射光看作“荧光”测量其弛豫寿命。此时所谓的“荧光”就是δ函数，因此测量结果就等于IRF。此外，如果有已知荧光寿命远小于系统时间分辨率的样品，也可以用于测试，测试结果近似等于IRF。
在这里，我们用硅片测量到了如下的IRF数据和曲线：



图3 仪器响应曲线

三、包含仪器响应函数的荧光寿命拟合

至此，我们所需的原材料已经备齐，可以开始进行卷积拟合。拟合方法本身源自Origin的官方帮助文档，感兴趣的朋友可以搜索并阅读原文：Help Online - Tutorials - Fitting with Convolution。简单地说，拟合方法的思路就是编写一个卷积程序，让Origin在每次拟合时都进行一次指数衰减函数和IRF的卷积，并把卷积结果和实验结果比较，确定是否拟合成功。接下来，我们要进行一些拟合前的准备工作。
第一步，新建拟合函数。1. 按快捷键Ctrl+Y打开拟合窗口，点击新建函数(new)，2. 输入函数名FitConv，3. 选择函数类型为Origin C，4. 点击下一步，5. 在第二个页面输入参量y0,A,t, 6. 点击下一步，7. 在第三个页面中打开代码编辑器。



图4 新建拟合函数其一

• 打开代码编辑器后，在第4行，即粉红色的<origin.h>的下面插入两行头文件：
  

#include <ONLSF.H>
#include <fft_utils.h>2. 之后在第40行，即灰色的Beginning和End of editable part之间插入
NLFitContext *pCtxt = Project.GetNLFitContext();
        Worksheet wks;
        DataRange dr;
        int c1,c2;
        dr = pCtxt->GetSourceDataRange(); //Get the source data range
        dr.GetRange(wks, c1, c2);  //Get the source data worksheet
        if ( pCtxt )
        {       
                // Vector for the output signal in each iteration.
                static vector vSignal;
                // If parameters were updated, we will recalculate the convolution result.
                BOOL bIsNewParamValues = pCtxt->IsNewParamValues();
                if ( bIsNewParamValues )
                {
                        // Read sampling and response data from worksheet.
                        Dataset dsSampling(wks, 0);
                        Dataset dsResponse(wks, 2);
                        int iSize = dsSampling.GetSize();
                       
                        vector vResponse, vSample;
                       
                        vResponse = dsResponse;
                        vSample = dsSampling;

                        vSignal.SetSize(iSize);
                        vResponse.SetSize(iSize);
                        vSample.SetSize(iSize);
                       
                        // Compute the exponential decay curve
                        vSignal = A * exp( -t*vSample );
                        // Perform convolution
                        int iRet = fft_fft_convolution(iSize, vSignal, vResponse);
                        //Correct the convolution by multiplying the sampling interval
                        vSignal = (vSample[1]-vSample[0])*vSignal;

       
                }
               
                NLSFCURRINFO    stCurrInfo;
                pCtxt->GetFitCurrInfo(&stCurrInfo);
                // Get the data index for the iteration
                int nCurrentIndex = stCurrInfo.nCurrDataIndex;
                // Get the evaluated y value
                y = vSignal[nCurrentIndex] + y0;
                // For compile the function, since we haven&#39;t use x here.
                x;
        }3. 点一下左上角的编译按钮（Compile），4. 看看编译是否通过（Done）。5. 编译完成后点击左上角的返回对话框（Return to Dialog），再点击下一步、结束即可完成拟合函数的新建。此时我们先关闭拟合对话框。



图5 新建拟合函数其二

第二步，处理IRF数据。在使用新建的卷积拟合之前，我们还需要对测量到的IRF进行处理。首先将IRF归一化，除以其最大值；然后尽可能删去前后没有信号只有噪声的部分，只保留峰值；最后在数据最前面插入若干个0，直到IRF的上升沿与荧光数据上升沿的最前端对齐。将处理好的数据放在C列上。



图6 IRF数据的拟合前处理

第三步，开始拟合。此时我们的数据本上A、B、C三列应该分别是x轴数据、待拟合荧光数据和处理后的IRF数据。1. 选中B列，按快捷键Ctrl+Y开始拟合。2. 选择刚才新建的FitConv函数，3. 在设置（Settings）-拟合曲线（Fitted Curves）-X数据类型（X Data Type）中选择 4.“与输入数据相同（Same as Input Data）”。在拟合参数选项卡中，先将弛豫时间 t 手动初始化为一个接近的值，通过点击 5. “计算卡方（Calculate Chi-Square）”观察拟合函数与原始数据的吻合情况，点击“一次迭代（1 Iteration）”观察拟合函数是否收敛。判断拟合参数大致收敛后，点击“拟合至收敛（Fit Until Converged）”。需要注意由于卷积计算时间较长，如果没有手动调整参数的过程，迭代拟合将非常缓慢。



图7 拟合过程

至此，我们完成了包含仪器响应函数的时间分辨荧光谱拟合。可以比较用简单拟合和卷积拟合得到的拟合曲线以及荧光寿命。



图8 对信号分别使用简单拟合和IRF卷积拟合得到的结果

<hr/>（以下是进阶部分）

• 手动补零对齐IRF的上升沿与荧光数据上升沿总是不精确的，如果想让拟合更加准确，可以添加一个拟合参量t0，并将OriginC程序原本68行的
  

vSignal = A * exp( -vSample/t );改为
vSignal = A * exp( -(vSample-t0)/t ) * 0.5*(1+erf( 1000*(vSample-t0) ));不过t0只有大于0时才有效果，即拟合函数只能向坐标轴右侧移动。

• 如果荧光寿命是双指数弛豫的，可加入拟合参量A2、t2，将68行改为
  

vSignal = (A * exp( -vSample/t )+A2 * exp( -vSample/t2 ));

• 按照上述方法得到的拟合结果中，OriginC代码的72行
  

vSignal = (vSample[1]-vSample[0])*vSignal;起到了修正拟合幅值的作用，如果删去会导致拟合幅值结果不正确。
<hr/>tips：
不删去IRF多余的噪声会导致卷积值过大。
卷积是周期性的，如果弛豫时间过长导致拟合函数坐标轴右侧没有趋于0，那么这个弛豫过程会回到坐标轴左侧，导致拟合不正确。

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