PCR定点突变实验实操-一看就会

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背景知识介绍
在构建突变载体时，需要把某个位点进行点突变，以观察最终产物的功能影响。目前引入突变的目前主要常用的方法有CRISRP, Base editing, Prime Editing，还有PCR定点突变。当然，还有另外两种基因编辑技术：转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN）技术与锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）技术。本次主要介绍PCR定点突变。

一.引物设计原则：
1. 引物3’末端最后5到6个核苷酸最好完全匹配，5’端可加入酶切位点、保护碱基或突变碱基等。
2. 3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
3. 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%。

二. PCR引入定点突变的方法：
一、重叠PCR方法：
在欲扩增的片段，其中红色(加粗)为欲突变位点，其中F2和R2反向互补，在F2和R2引入突变位点。



（PCR重叠法构建点突变基本原理图）

### 实验步骤
（1）第一次PCR：引物F1+R2（R2引入突变碱基）
引物F2+R1 （F2引入突变碱基）
（2）PCR完成后琼脂糖凝胶跑胶，分别切胶回收
（3）第二次PCR：切胶回收得到第一次PCR产物，以其作为模板，再用F1+R1为引物行第二次PCR
（4）PCR完成后琼脂糖凝胶跑胶，切胶回收，回收产物送测序确定突变

二、多重PCR法：突变序列直接设计靠近5’或3’端

模板上欲扩增的片段，其中F1引物5’端红色为欲突变的碱基



（多重PCR构建点突变示意图）

###实验步骤

（1）第一次PCR：引物F1+R1（F1的3’端与模板有>=18个碱基配对，F1引物红色5’端引入突变碱基）
（2）以第一次PCR产物为模板，以F2+R1引物做第二次PCR：引物（F2与第一次PCR产物配对）
（3）以第二次PCR产物为模板，以F3+R1引物做第二次PCR：引物（F3与F2产物配对）
（4）PCR完成后琼脂糖凝胶跑胶，分别切胶回收，回收产物送测序确定突

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