甲基化特异性PCR（MSP）实验全流程与实验结果

Rose

MSP法的原理是基于DNA经亚硫酸氢钠处理后，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。基于这种碱基的改变，然后根据甲基化位点设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应（PCR）扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。
这种方法适于研究中大量样本的DNA片段，具有方便快捷，灵敏度高的优点，是目前较为常用的甲基化检测方法。


一、实验方法

参考文献PMID：20215641
1、DNA提取：应用基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书进行操作，提取基因组DNA，应用紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度 ，置于-80℃冰箱保存备用。
2、MS-PCR：采用EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research，USA) 对DNA进行亚硫酸钠处理，利用反应柱进行脱硫及净化，纯化后DNA可用于后续PCR反应，针对××基因启动子CPG岛富集区设计甲基化和非甲基化引物。
3、PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95℃变性45 s、58℃ (甲基化) /57℃(非甲基化) 45 s、72 ℃退火45 s，35 次循环；最后72 ℃延伸10 min。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析。
【注意】：如××基因启动子区的CpG岛完全甲基化，则只有甲基化引物能扩增出目的条带；如完全未甲基化，则只有非甲基化引物能扩增出目的条带；如为部分甲基化，则两对引物均能扩增出目的条带。部分甲基化归为甲基化范畴，每个实验重复3次。

二、实验操作流程

1、DNA提取

DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书进行操作，提取基因组DNA，应用紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度 ，置于-80℃冰箱保存备用。
2、亚硫酸氢钠处理

采用EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research，USA) 对DNA进行亚硫酸氢钠处理，利用反应柱进行脱硫及净化，纯化后DNA可用于后续PCR反应。





3、MSP引物设计-寻找启动因子

针对××基因启动子CPG岛富集区设计甲基化和非甲基化引物。




在NCBI寻找启动子区域网站中，输入要查询基因名，点击搜索。
网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/



点击 see related箭头指示部位。



点击sequence，再点击 configure this page。



flanking sequence 输入 3000，再点击右上角对勾，回到原界面，滑轮往下。



外显子的上一个碱基，（蓝色部分）。


4、MSP引物设计-寻找甲基化

在序列框内输入上步中查找到的基因启动子序列，选择MSP引物，点击Submit（同理：此处也可以选择BSP，结果获取的则是BSP引物）
甲基化引物设计网站：http://www.urogene.org/cgibin/methprimer/methprimer.cgi



出现下一个页面，即可得到该基因MSP甲基化引物的相关信息



三、实验结果

1、PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95℃变性45 s、58℃ (甲基化) /57℃(非甲基化) 45 s、72 ℃退火45 s，35 次循环；最后72 ℃延伸10 min。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析。
2、如××基因启动子区的CpG岛完全甲基化，则只有甲基化引物能扩增出目的条带；如完全未甲基化，则只有非甲基化引物能扩增出目的条带；如为部分甲基化，则两对引物均能扩增出目的条带。部分甲基化归为甲基化范畴。
（参考文献PMID：20215641）



3、对于组织水平甲基化检测某基因发生甲基化后促癌，可以统一处理为：正常组织是非甲基化状态，癌组织是甲基化状态，都只有M和U中的一条带。



4、PASSF1A启动子发生甲基化后，促进癌症发展。


5、MSP引物设计的原则，甲基化和非甲基化引物应该针对同一CpG位点。




6、MSP中M和U的引物是针对同一CPG位点设计的，所以跑出来的条带大小差别不会太大。只可能会存在些许差异，这是由于设计引物时会有1-6bp的差别。


7、MSP条带亮度在一定程度上可代表发生甲基化的基因启动子含量，即反映基因的甲基化水平，如下所示：
参考文献PMID：30646941
如：we observed that the methylation of the p21 promoter region was downregulated and that the amount of the promoter that was not methylated was upregulated when DNMTs were inhibited in hHFMSCsOCT4
译：当用5-aza-dc处理后，p21启动子区甲基化水平下调，未发生甲基化的启动子的数量上调。


8、结果部分：由图可知：与正常组织和细胞相比，癌组织和癌细胞中××基因启动子区CPG岛发生甲基化，用5-aza-dc处理癌细胞后，××基因启动子区CPG岛甲基化水平下调，只发生部分甲基化。（注：MSP法检测××基因启动子区CPG岛甲基化状态）


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