特殊蛋白WB技巧：膜蛋白、核蛋白跑WB的必看

营养师

特殊蛋白做WB实验困难重重？“无信号”“条带问题”频频出现？
本文将聚焦膜蛋白和核蛋白，带你详解在WB实验中这2款特殊蛋白的常见问题和注意事项。
另一款特殊蛋白：磷酸化蛋白之前也写过：简直强的可怕，磷酸化蛋白WB的成功经验总结！
一、膜蛋白做WB注意事项

膜蛋白是指能够结合或整合到细胞或者细胞器的膜上的蛋白质的总称。细胞膜上的膜蛋白称为质膜蛋白，而细胞器上的膜蛋白称为内膜系统膜蛋白，质膜蛋白约占细胞膜成分的30%
膜蛋白WB相对于其他蛋白更加困难，主要原因有：
提取困难：膜蛋白与膜结合紧密，不易从膜上洗涤下来，特别是跨膜蛋白，具有多重跨膜结构域，提取分离困难，样品质量差导致WB失败。
表达量低：膜蛋白在样品中的表达量通常不高，在总蛋白中占比较低，用总蛋白检测时，目标蛋白含量可能低于WB检测下限，无法检测到。
易形成多聚体：膜蛋白在热变性过程中容易形成多聚体，使抗体无法识别或条带分子量发生变化或扭曲。
分子量大：部分膜蛋白分子量较大，大分子量蛋白WB，电泳，转膜等条件需要摸索，较为困难。
基于以上原因，我们找到了一些解决膜蛋白WB困境的方法。
1、确认样品与蛋白特性

样品制备是WB实验至关重要的一步，制备方案的选择取决于使用的样品类型和蛋白特性。通过生信信息，我们可以快速了解目标膜蛋白在哪些组织中表达，是否具有特异性，是否是跨膜蛋白以及蛋白的分子量和在细胞中的分布及表达量情况。
判断方法举例
①目标膜蛋白表达量较好，且不属于跨膜蛋白，可以优先选择总蛋白提取检测。
②目标膜蛋白表达量比较低时，每条泳道可加入的蛋白总量是有限的，使用总蛋白检测时就限制了这些低丰度蛋白的检测。因此，最好需要预先富集膜蛋白，才更容易检出。
③目标蛋白跨膜次数越多，提取的难度相对越大，也最好预先富集膜蛋白后再检测。
④动物组织样本裂解难度大于培养的细胞样本，选用裂解液提取动物组织样本总蛋白时，要优先选用对膜蛋白提取效率更好的方法。
2、选择合适的蛋白制备方案

膜蛋白WB样品制备一般有2种方案可选：常规总蛋白制备方案和富集膜蛋白方案。
总蛋白制备方案操作简单，所需样品量低，实验成本低，在不需要进行膜蛋白定位验证相关实验的情况下，可以作为首选方案，尽量选择对膜蛋白提取效率高的配方和提取方案即可。
膜蛋白样品制备方案，更适合目的蛋白丰度很低，用总蛋白无法检出的样品，需要进行膜蛋白定位或组分间表达量对比的实验。
PS：实验初期可以两种方案同时尝试，也可以根据掌握的信息或预实验结果，从二者中选择更加合适的方案。
3、控制蛋白制样温度

膜蛋白在高温煮沸时，容易发生聚集现象，形成二聚体或多聚体，聚集后分子量变大，造成后续无法检测到条带或检出的条带位置不对。故膜蛋白样品不宜煮沸，建议根据蛋白具体属性在50-70 ℃左右进行热变性。
还有一些对热特别敏感的蛋白，对热变性的温度有特殊要求，例如植物样品。植物中对热敏感的蛋白比较多，有的蛋白热变性温度需要与感受态转化温度（42 ℃）一样，过高则检测不到。总而言之，如果样品是膜蛋白，需要根据样品本身情况，谨慎调整热变性的温度，以提高检测效率。对于跨膜蛋白，常用可参考的变性温度是50-70℃ 15min或者 37℃ 30min。
案例解析
SLC16A3蛋白是一种单羧酸转运体4（MCT4）蛋白，大小为49kDa左右，它参与乳酸和其他小分子单羧酸物质的跨膜运输。这种蛋白在许多生理过程中发挥作用，包括能量代谢和pH调节。


▲上样量: 30μg；SDS PAGE：10%；变性条件：95°C10min；转膜：湿转100v，120min；
▲实验分析：高温煮沸导致跨膜蛋白发生了聚集，无法被检测到；
4、优化大分子量膜蛋白电泳与转膜条件

凝胶浓度
凝胶浓度与孔径成反比，凝胶浓度越小，孔径越大，较大分子量的蛋白质更容易通过，所以对于高分子量蛋白(HMW，分子量>150KD)，电泳时使用Tris-Acetate 3-8% 凝胶是较好的选择，也可选择使用预制梯度凝胶。
电泳电压选择
电泳时可采用120-150V的高电压，在冰水浴中进行，尽量使Marker拉开足够大的距离，通常需要4h左右。
PS：电压120V，4 h，245KD Marker条带差不多到分离胶中间位置，蛋白上样缓冲液会漏到电泳槽，不要回收电泳液，以免污染下一次实验的结果。
转印注意事项
转印膜建议使用0.45um的PVDF膜；
转膜液中的甲醇容易让大分子量蛋白沉淀，所以减少转膜液中的甲醇百分比（10%或更低），并添加SDS至终浓度0.1%以稳定蛋白；
高分子量蛋白WB建议湿转，转膜时间可参考下表：


大分子&小分子蛋白做WB注意事项之前也写过：大（小）分子蛋白WB如何跑出漂亮条带？这几个步骤一定要优化！
5、合理设置对照和内参检测

对照和内参检测在WB验证中起到重要作用，务必要设置。设置阳性对照可检测WB的有效性，检测内参，可以验证蛋白上样量及样品质量是否合格。总蛋白内参可选择Actin，Tubulin，GAPDH等，膜蛋白内参可选择Na+/K+ ATPase，Pan-cadherin等。
膜蛋白WB经验总结

膜蛋白WB检测难度高，选择合适的蛋白制备方案，提高样品中膜蛋白的含量是重中之重，控制膜蛋白热变性温度，优化大分子量膜蛋白电泳与转膜条件，合理设置对照和内参作为质控，即可获取完美的膜蛋白WB结果。

二、核蛋白做WB注意事项

细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞结构，是细胞遗传与代谢的调控中心，是真核细胞区别于原核细胞最显著的标志之一（极少数真核细胞无细胞核，如哺乳动物的成熟的红细胞，高等植物成熟的筛管细胞等）。它主要由核膜、核孔、染色质、核仁、核基质等组成。
核蛋白因在细胞内含量占比低，且一般的提取方法不易富集，所以研究过程通常较为困难。
这时我们就面临一个问题：WB目的蛋白为核蛋白时，是否需要提取核蛋白再做？提取总蛋白能做出来吗？
结合以下几点，我们可以解决这个问题：
1、确认蛋白表达水平

细胞内某一蛋白质的表达水平是指细胞内该蛋白质的合成速率和数量。通常情况下，细胞内的蛋白质表达水平受到基因转录和转译的影响。细胞内的蛋白质表达水平可能会受到外界因素（如药物和病毒感染）的影响，也可能会因为细胞内的调控机制而发生变化。
可以借助UniProt、BIOGPS、GEPIA、The Human Protein Atlas等工具查询相关蛋白信息。
2、确认实验目的

确认蛋白的表达水平后，还要确认实验目的，一般有如下2类实验目的：
蛋白定性/半定量
①  通过WB检测蛋白质溶液中目的蛋白质的存在与否（定性）；
②  通过WB确定同一蛋白质在不同样本中的多与少（半定量）。
蛋白定位/转运/表达量对比实验
① 蛋白质亚细胞定位：细胞可以分成多个细胞器或者细胞区域，如细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、高尔基体、内质网等，这些细胞器被称为“亚细胞”。通过WB确定目的蛋白质所在的亚细胞位置。
② 蛋白转运：各种蛋白质合成之后要分别运送到细胞中的不同部位，以保证细胞生命活动的正常进行。通过WB确认目的蛋白在细胞不同部位的转移情况。
③ 组分间表达量对比：目的蛋白在不同组分间均有表达，通过WB确认组分间表达量的差异。
3、根据情况确认制备样品类型

根据目的蛋白表达水平和实验目的即可确认是该使用总蛋白还是核蛋白提取。


4、核蛋白的样品制备

当确认需要分离核蛋白再做实验时，尽量选择分离后交叉污染低且操作简单的方法。
这里给大家分享2个比较好用的核蛋白提取方法：
对于HIF1-α、TWIST等在细胞核中表达较高的蛋白，应采用专门的细胞核蛋白提取试剂盒或细胞核蛋白裂解液进行提取。
PS：预算紧张可以选择方法一，有条件可以选择方法二。
方法一  匀浆器研磨法
准备工作
Trypan blue染液配方：取Trypan blue粉剂，溶于10mL双蒸水中，配成4% w/v台盼蓝母液。使用时，用PBS缓冲液稀释10倍至0.4%浓度，与细胞悬液混匀。
Bufer A 配方：10mM HEPES (pH 7.9，4℃)，1.5mM MgCl2，10mM KCl，0.5mM DTT（如担心浆蛋白降解对核蛋白产生影响，可加入1mM的PMSF）。
Buffer B 配方：20mM HEPES (pH 7.9)，25%(v/v) glycerol，0.42M NaCl，1.5mM MgCl2，0.2mM EDTA，0.5mM PMSF，0.5mM DTT。
核蛋白提取步骤
①将细胞自瓶壁上消化下来，收集于Eppendorf管，4℃下，300g离心5min，并用PBS洗涤3次；
②离心后，弃上清，加入5倍体积预冷的Buffer A（每20μL细胞沉淀加入100μL）吹打，使细胞悬浮；
③冰上放置10min后，4℃下，300g离心5min，加入25倍体积预冷的Buffer A吹打，使细胞悬浮；
④将细胞悬液移入Dounce匀浆器中，进行匀浆；
⑤匀浆过程中，取微量细胞悬液，与0.4% Trypan blue染液等体积混匀，于显微镜下观察细胞破膜情况。若大部分细胞均被染成蓝色，则停止匀浆；否则，继续匀浆；
⑥大部分细胞被破膜后，将细胞悬液转移至Eppendorf管，4℃下，25000g离心20min；
⑦离心后，上清包含细胞裂解物中的胞浆成分；沉淀包含核蛋白；
⑧收集沉淀，加入1倍体积预冷的Buffer B，轻轻吹打，使沉淀呈悬浮状态。将悬浮液转移入干净的组织匀浆器中，均匀用力匀浆30次；
⑨将悬浮液转移至Eppendorf管，冰上低速摇床45min；
⑩4℃下，25000g离心30min，收集的上清液为细胞核蛋白。
方法二  试剂盒法
准备工作
将细胞核蛋白提取试剂盒平衡至室温，向浆蛋白提取试剂与核蛋白抽提试剂中加入PMSF，至终浓度为1mM。若样品含有半胱氨酸，则向两种试剂中加入DDT，至终浓度为0.5mM。
核蛋白提取步骤
①将细胞自瓶壁上消化下来，收集于Eppendorf管，在4℃下，300g离心5min , 并用PBS 洗涤1-2次；
②4℃下，300g离心10min 后，弃上清，加入5倍体积的浆蛋白提取试剂（每20μL细胞沉淀加入100μL），轻轻上下颠倒混匀细胞，注意勿涡旋；
③将细胞悬液置于冰上20min；
④4℃下，250g离心20min，弃上清，细胞沉淀加入2倍体积的预冷的浆蛋白提取试剂；
⑤用针头直径为0.14mm的注射器吹打5次；于4℃下，10000g离心30min；
⑥离心后的上清液包含胞浆蛋白，沉淀包含核蛋白。取沉淀继续以下操作；
⑦加入50-100uL的核蛋白抽提试剂后，用针头直径为0.14mm的注射器吹打5次，冰上低速揺床45min；
⑧4℃下，16000g离心5min，收集的上清液为细胞核蛋白。
组织核蛋白提取步骤
①称重后，尽可能切成非常细小的碎片；
②每50mg组织加入300-500μL PBS，冰浴条件下，用匀浆器充分匀浆，构造悬液；
③4℃下，将细胞悬液500g离心3min，吸弃上清，收集沉淀；
④在收集的沉淀中，加入200μL浆蛋白提取液，参照上述步骤3及后续步骤，即可完成核蛋白的提取。
5、内参选择

目标蛋白为核蛋白时，内参选择可以分为以下2种情况：
情况一
使用总蛋白为样品，检测其中目标细胞核蛋白的表达情况时，可以使用管家基因作为内参。因为它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，使用总蛋白作为样品时，可以用来做参照物，校正蛋白质定量及上样过程中存在的误差，保证实验结果的准确性。亦可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个蛋白免疫印迹显色发光体系是否正常。
常用的管家基因内参推荐：
Actin：即肌动蛋白，分子量42kDa，是一类形成微丝的球状多功能蛋白质，基本上存在于所有真核细胞中。哺乳动物至少有6种肌动蛋白异构体由不同的基因编码， 根据它们的等电点分为三类（α， β和γ），一般来说，α肌动蛋白存在于肌肉中（α-骨骼，α-主动脉平滑，α-心脏），而β和γ在非肌肉细胞中很突出（β-细胞质，γ1-细胞质，γ2-肠道平滑）。
Tubulin：即微管蛋白，分子量约55 kDa，微管蛋白是球形分子，有两种类型：α微管蛋白(α-Tubulin)和β微管蛋白(β-Tubulin)。
GAPDH：是糖酵解反应中的一个酶，分子量36kDa。广泛分布于各种组织中的细胞，几乎在所有组织细胞中都高水平表达，在同种细胞或组织中的表达量一般是恒定的，且很少受外部诱导物的影响。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达。
以上3种内参可以满足80%以上的WB实验需求。
情况二
另一种使用分离出的细胞核组分作为样品，检测目标核蛋白的表达，定位或者是与其他组分间的表达差异。这些实验是验证细胞核定位相关的实验，此时需要使用细胞核的专用内参，并同时添加管家基因内参。证实使用的样品是细胞核蛋白的同时，且不含有其他组分的干扰。
推荐如下细胞核内参：
Lamin A/C、Lamin B、核孔蛋白(NUP98)——存在于核膜上
核纤层（nuclear lamina）是位于内核膜下与染色质之间的一层由高电子密度纤维蛋白质组成的网络片层结构，主要化学成分是核纤层蛋白（lamin），主要分为核纤层蛋白A、B、C。
核仁蛋白——存在于核仁上
核仁是细胞核内的一种非膜状结构，负责转录和组装核糖体RNA。核仁的蛋白组成部分也可用作标记物，例如原纤蛋白Nop1（位于核仁原纤维中心）、Nop2核仁蛋白（位于核仁）等。
但需注意在蛋白质合成不活跃的细胞中，如精子和肌细胞中核仁不明显或不存在，这时候就要慎用核仁蛋白作为标记物。
核蛋白WB经验总结

WB目的蛋白是核蛋白，并非一定要提取核蛋白才能进行实验，需要根据实验目的及目的蛋白表达水平决定。目的蛋白表达水平低的WB定性实验，优先考虑提取核蛋白降低实验难度，或获取更全的总蛋白。做蛋白定位或蛋白转运，组分间表达量对比等实验，则必须进行核蛋白的分离才能进行实验。


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