获得某一个蛋白的互作蛋白11种方法！

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蛋白质-蛋白质相互作用是生物体重要的生命过程之一，涉及到细胞信号转导、细胞结构组装、抗原-抗体识别等诸多生理现象。获取某一个蛋白的互作蛋白有哪些方式？这么多实验该怎么选择？
不慌，一篇文章带你盘点清楚，从各种蛋白互作实验原理到具体研究中该选择哪种实验验证，这篇文章包你明明白白的！
一、常见的蛋白互作方法盘点

1.免疫沉淀（IP）

免疫沉淀IP是利用抗体特异性反应富集纯化目的蛋白的一种方法，可用于目的蛋白的定性和定量分析。
IP 实验原理
将含有目的蛋白的样品溶液与特异性抗体结合，该抗体的Fc片段又能结合到protein A/G上，protein A/G（结合了protein A和protein B的IgG结合结构域，具有与IgG的Fc片段特异性结合的能力，可用于抗体的亲和纯化。）通常会固定在琼脂糖颗粒或磁珠上，进而吸附目的蛋白，后续再通过离心收集、洗脱、溶解等步骤分离获得目的蛋白。抗体可以预先固定在固相支持物（琼脂糖或磁珠上）；也可以先是游离状态时与目的蛋白结合后再结合到固相支持物上，回收抗原-抗体复合物。




IP 实验流程
1）收集细胞于离心管中，4 ℃以500 g离心5 min，弃上清；使用预冷的1×PBS洗涤细胞1-2次，同时离心去除上清；
2）加入500 μL含蛋白酶抑制剂的IP裂解/洗涤缓冲液于冰上裂解细胞30 min；
3）将裂解液于4 ℃以10000 g离心30 min，取上清；
4）预留少量上清液（约10-20 μL）用于WB实验，作为Input样本；
5）将2-10 μg的抗体（具体参考抗体说明书）与剩余的上清液混合，在4 ℃摇床孵育1 h或过夜，以形成抗原-抗体复合物；
6）根据试剂说明书制备protein A/G-beads，将抗原-抗体复合物与50 μL的protein A/G-beads混合，4 ℃摇床孵育1-4 h，4 ℃以3000 g离心5 min收集沉淀，小心弃去上清；
7）用500 μL裂解缓冲液洗涤protein A/G-beads 3-4次，每次洗涤后需离心；
8）根据相应的洗脱方法，使用50 μL洗脱缓冲液洗脱抗原-抗体复合物，得到目的蛋白；
9）对目的蛋白进行WB检测或MS分析。


<hr/>2.免疫共沉淀(CO-IP)

Co-IP是免疫沉淀（IP）的延伸，主要用于蛋白-蛋白相互作用检测。是一种以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究体内(in vivo)蛋白质相互作用的经典方法，用于确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用。
Co-IP实验原理
基于IP反应捕获和纯化靶蛋白，如果样品溶液中存在与靶蛋白相互作用的目的蛋白，也会被一同捕获及纯化得到，随后利用SDS-PAGE、Western Blot等手段对得到的目标蛋白进行分析。
与其它研究方法相比，免疫共沉淀的优势在于该体系是在生理条件下检测蛋白质之间的相互作用，因此，不仅可以检测到体内形成的天然复合体，而且可排除过表达靶蛋白所带来的假阳性。其次内源性的靶蛋白质是完全加工、修饰和成熟的蛋白质，因此，依赖于修饰的蛋白质相互作用也能被检测到。


IP 和Co-IP 的区别在哪里？
IP是为了通过免疫沉淀富集和检测某一特定蛋白，为后续分析提供高纯度的样本。
Co-IP 是通过免疫沉淀获得已知的蛋白及其互相作用的蛋白，以确定这两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的方法。
Co-IP实验流程
1）样品裂解-裂解液；
①去掉培养基，用冰PBS清洗一次；
②去掉PBS，每个板（10cm）中加0.5mL冰预冷的1X细胞裂解液，在冰上孵育5min；
③将所有细胞刮下，收集到离心管，置于冰上；
④冰浴中对样品用超声处理3次，每次5秒钟。（此步骤对膜蛋白提取有较好作用）；
⑤4 ℃，14000xg离心10min，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物；
⑥BCA测定浓度。
2）样品的预纯化-normal IgG/微珠；
①取200 μL 1 mg/mL的细胞裂解物与30μL 50%的PreteinA/G微珠（琼脂糖或磁珠）混合，4 ℃孵育30-60min；
②通过离心或者磁性分离去除微珠；
③留取上清进行后续实验。
3）与目标蛋白抗体共孵育-IP抗体、Normal IgG；
①向蛋白裂解液中加入适量一抗。抗体量及终浓度要通过预实验（梯度稀释）或者查阅文献和说明书来确定；不要加太多的一抗，否则背景较高；
②4 ℃翻转孵育过夜；
③平行样本：使用合适的Isotype Control。
4）免疫共沉淀-微珠；
①Day2，加入30 μL 50%的Protein A/G珠子（200-500 μg蛋白 ）。建议将枪头去剪，防止加Protein A/G 时损伤珠子；
②4℃翻转孵育1-3h；
③很多情况下，抗体孵育和免疫共沉淀步骤合并，直接加入固定化抗体（与微球偶联），在4 ℃孵育过夜。
5）微珠清洗-裂解液；
①加入500 μL Wash buffer；
②重悬，颠倒数次；
③4 ℃离心，弃上清；
④重复4-5次。
6）洗脱；
①加入3XSDS buffer 20-30μL，震荡、离心；
②煮样2-5min，14000x g离心1min；
③取上清上样15-30μL；
④样品可储存于-80 ℃。
7）WB 分析或其他分析-WB一抗、二抗。




<hr/>3.GST pull-down

GST-pulldown技术主要用于研究体外强烈或者稳定的蛋白质间相互作用，可以验证两种已知的蛋白质可能存在的直接相互作用或者寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知靶蛋白，且体外验证蛋白直接相互作用时有较强的特异性。
GST pull-down 实验原理
将靶蛋白-GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽琼脂糖磁珠上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶与之孵育，从而捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物通过SDS-PAGE 电泳分离，最后经western blot 或质谱分析，从而证实两种蛋白间的相互作用。


co-IP 和GST pull-down区别在哪里？
Co-IP反映的是两个蛋白在体内或细胞水平的相互作用，因为在进行CoIP检测时，样本一般源于非变性裂解细胞，活细胞状态下蛋白质之间的相互作用被保持，所以其反映的是细胞中真实的蛋白互作情况，但是诱饵蛋白和靶标蛋白之间是直接作用还是有其它蛋白介导的间接相互作用无法确定。
在实验难度上，因为固相复合物组分多，需要非变性环境，并且对诱饵蛋白抗体的质量有较高要求，整个实验相对而言难度较大。
GST pull-down一般用于体外实验，因为诱饵蛋白是需要加上GST标签的重组蛋白，所以是非生理状态下的验证，蛋白质的结构和形式可能与天然状态下存在一定差异，一般用于体外验证两个已知蛋白的直接相互作用。这种方法的作用在于检测两种蛋白在体外是否发生直接结合。
在实验难度上，重组诱饵蛋白一般采用原核表达体系，有高效的商业化载体（真核表表达体系也可以做，但需要找到合适的载体）；并且固相复合物组分更少，有商业化的GSH琼脂糖珠，整个实验相对而言难度较低。


GST pull-down 实验流程
1）蛋白的抽提与纯化：原核表达蛋白分离纯化
①在裂解液上清中加入适量体积50%谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B，4℃摇床上缓慢摇动30~60min;
②4℃，4000rpm离心5min，弃去上清；
③加入200ul预冷的PBS溶液，轻晃悬浮珠子，洗涤一次，4℃，4000rpm离心5min，弃去上清，重复此步骤3次；
④吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST-A的琼脂糖凝胶。
2）真核表达蛋白抽提
3）体系孵育与pull-down
①混合含有A-GST蛋白和含有其他蛋白的溶液，将混合物在4°C旋转混匀孵育过夜;
②4℃，4000rpm离心5min，弃去上清液后，用预冷缓冲液进行洗涤，重复三次；
③吸干琼脂糖凝胶上方的水层后，加入1×蛋白电泳上样缓冲液，将蛋白样本煮好后，分装冻存于-80℃冰箱，用于后续检测。
4）GST pull-down 验证与结果分析
GST pull-down实验经过考马斯亮蓝和Western blot检测后即可进行结果分析。

<hr/>4、Far-Western Blotting

Far-western blotting 该技术是由 Western blotting 衍生而来研究蛋白质相互作用的方法，是一种体外检测蛋白间相互作用的分子生物学方法。它可以验证已知蛋白间的相互作用，或分析已知蛋白和未知蛋白间的相互作用。由于该方法灵敏度较高，现已得到广泛的应用。
Far-western blotting实验原理
在Westernblot实验中，用特异性抗体（一抗）去检测膜上的蛋白，HRP标记的二抗与一抗结合，通过显影观察膜上的蛋白。而在Farwesternblot中，将靶蛋白固定在PVDF/NC膜上，用诱饵蛋白(已知蛋白）作为探针去检测膜上的靶蛋白，再利用特异性抗体孵育、检测，以此来分析靶蛋白和诱饵蛋白间的相互作用。


Far-westernblot实验流程
1）取溶于DMSO中的地高辛少量加入到 1 mL（0.3 µg/µL）的蛋白A中，室温下轻微振荡 2 h 后，PBS透析过夜。
2）取不同目的蛋白各20 µL，跑两份相同的SDS-PAGE，其中一份进行考染，另一份用湿转法转移至PVDF膜上。
3）用封闭液（2% BSA）封闭PVDF 膜，4 ℃  振荡过夜。
4）用 PBS-T 清洗 PVDF 膜三次，每次振荡5 min。
5）用封闭液（2% BSA）配制稀释好的蛋白A抗体，PVDF 膜置于其中 37 ℃孵育1-2 h。
6）重复步骤 4。
7）用封闭液（2%  BSA）配制稀释的抗体，PVDF膜置于其中37 ℃孵育1-2 h。
8）重复步骤4后用显色液暗处显色。显色结束后用清水冲洗，PVDF膜浸于清水中。
<hr/>5、酵母筛库

包括酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）、膜酵母双杂交（Membrane Yeast Two-Hybrid，MYTH）、分子三杂交等。这个是目前较主流的方法之一。
酵母双杂实验原理
酵母双杂交系统是鉴定和验证蛋白质互作的最常见和最直接的方法。首先将称为bait（诱饵）的蛋白（即已知蛋白）构建在BD载体中，并表达BD-bait融合蛋白；将prey（猎物）蛋白（即待测蛋白）构建在AD载体上，表达AD-prey融合蛋白。如果bait和prey之间没有相互作用，那么BD和AD就不能结合，下游的报告基因也就不能被激活。这里的报告基因可以是营养缺陷等基因(最后可以通过观察酵母是否生长来看是否存在互作)。该系统最大的优点是待测蛋白在实验过程中能够保持天然构象，从而提高了检测的准确性和灵敏度。


酵母双杂交有比较适用的应用领域：
⑴ 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵ 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
酵母双杂实验流程
1）酵母双杂文库构建
①提取RNA
②反转录成cDNA
③均一化
④cDNA构建到pGADT7载体上
⑤构建好的质粒文库转入酵母菌
⑥平板涂布挑取阳性克隆
⑦阳性克隆PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定文库质量
⑧文库全测序，确定文库所含具体序列
2）酵母双杂文库筛选
①文库质粒转化酵母
②报告基因转录表达
③平板涂布筛选阳性克隆
④阳性克隆PCR扩增鉴定
⑤阳性克隆回转验证
⑥全克隆NGS测序
6、蛋白质芯片（Protein Microarray）

通过将大量蛋白质固定在芯片表面，然后与目标蛋白质孵育并检测信号，可以高通量地筛选互作蛋白。
7、表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）

表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。
SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
8、生物膜干涉BLI

生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry, BLI），是一种非标记（Label-free）光学生物传感技术，用于实时监测分析生物分子相互作用（例如抗原-抗体相互作用），并对其结合强度和动力学进行量化分析。与SPR技术不同的是，BLI技术中不使用金属芯片，而是利用生物传感器，将配体偶联在传感器的末端，浸入样品中来捕获分析物。


当光束射出后，对来自生物传感器末端表面的反射光进行测量，如果配体与分析物相互作用，则末端表面的膜层比仅有配体（未结合分析物）的膜层更厚，反射光波长也不同，两种反射光谱之间的波长形成一束干涉光谱。BLI仪器通过测量来自配体，或配体-分析物的复合物的干涉光谱位移值，实现结合强度和动力学的实时监测。
9、邻近蛋白标记BioID

邻近蛋白标记（Biotin identification，BioID，生物素标记）方法可以鉴定诱饵蛋白附近的蛋白质。通过将生物素连接酶（BirA）与诱饵蛋白融合表达，加入适量生物素，融合蛋白的相互作用/临近环境中的蛋白质会被生物素化。之后通过链霉亲和素或Strep-Tactin®进行亲和纯化，将被生物素化的蛋白质从细胞裂解液中富集出来，产物进行质谱鉴定。
10、蛋白质互作网络数据库

可以利用生物信息学工具和数据库预测蛋白质相互作用。例如，通过整合已有的实验数据，构建蛋白质相互作用网络，从而预测目标蛋白的潜在互作蛋白。
1）STRING
官网：https://string-db.org/
老牌的蛋白相互作用数据库，数据有保障。研究蛋白之间互作网络，有助于挖掘核心调控基因。覆盖物种最多，互作信息最大，可输入蛋白质名称或序列，单个或多个蛋白。
输入基因名称后，可以获得蛋白互作网络图，其中圆圈节点之间的直线代表该直线连接的两个蛋白之间的相互作用关系，点击直线可查看蛋白的详细信息。
不同颜色的直线代表不同的相互作用关系证据来源。包括蛋白质之间的直接物理相互作用，也包括蛋白质之间的间接功能相关性。它除了包含有实验数据、从PubMed摘要中挖掘的结果和综合其他数据库数据外，还有利用生物信息学的方法预测的结果。


2）IID
官网：http://iid.ophid.utoronto.ca/SearchPPIs/protein/
预测蛋白质-蛋白质相互作用，可以精确到器官特异性的蛋白相互作用数据库。
IID 收录了 18 个物种（包括人类、5 个模式生物和 12 个驯化物种）中检测到和预测到的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。
该数据库为蛋白互作注释了全面的信息，包括发生条件（如发育阶段、组织）、跨物种保护、方向性、可药用性、持续时间以及在由两个以上蛋白组成的蛋白复合物中的相互作用。


3）BioGRID
官网：https://thebiogrid.org/
存档和传播多个模式生物和人类的遗传和蛋白质相互作用的数据。
BioGRID是一个生物医学互动库，通过全面的管理工作汇编数据。目前的索引版本为4.4.235，检索了85，077篇出版物，其中包括2，785，606种蛋白质和遗传相互作用，31，144种化学相互作用和1，128，339种主要模式生物物种的翻译后修饰。所有数据都通过搜索索引免费提供，并以多种标准格式提供下载。
结果可以看到哪些基因具有相互作用以及基因之间相互作用是实验还是预测。


4）HPRD
官网：http://hprd.org/index_html
通过该数据库我们可以方便的查询某个蛋白的相互作用网络，但是对于多个蛋白间的相互作用网络，只能自己从下载的数据文件中处理得到。
HPRD全称Human Protein Reference Database, 是一个专门存储人类蛋白质相互作用信息的数据库，和其他同类数据库相比，HPRD中的所有信息都是由阅读、解释和分析已发表数据的专家生物学家从文献中手动提取的，该数据库中存储的蛋白质互作信息都是经过实验验证的，而且数量上有明显优势。
除了数据质量和数量上的优势，HPRD还提供了蛋白质的表达谱，分类，结构域，亚细胞定位，转录后修饰，通路等其他信息。


11、文献查询

除了以上的方法，最后就是通过文献找到目标蛋白的互作蛋白信息。通过查阅大量同源蛋白的方法，获取目标蛋白最有可能互作的蛋白信息然后进行验证。这既避免了刚想到一个相关蛋白就看到别人文章已经发表的尴尬问题，也能更加有效的确定可操作的相关蛋白。
二、研究蛋白互作的方法该咋选？

首先在文献/数据库查找你研究的目的蛋白的互作蛋白信息，确定好了是不是真的要做这个蛋白之后呢再进行实验验证。

1、一般来说研究蛋白互作实验验证会先考虑用COIP，可以研究到生物体内蛋白互作，但是可能会出现不适合的情况：
比如：结合力弱的互作关系，不合适~（想去IP下来结合蛋白，结果一下就散了）
比如：本底蛋白表达低，也不适合！（要是本身想拉的蛋白就少，那与之相结合的蛋白也会很少）

2、那要是COIP不能检测到蛋白互作，GST pull-down就要派上用场了！
相比COIP检测到的蛋白互作关系可能是第三个蛋白作为桥梁建立的，与之相比，pull down技术可用于检测蛋白之间的直接互作关系。
但是GST pull-down是在试管中进行的生化反应，不能够完全反应细胞内蛋白真实互作状态，也确实没办法做到说像COIP一样模拟细胞内天然的互作环境。

所以现在大家的研究思路是：
先用COIP证明蛋白之间在体内互作，拉下了蛋白的复合物；再用GST pull-down技术去证明直接互作，同时还可以通过巧妙设计诱饵蛋白结合域，判断出两蛋白互作的具体区域。
总之，GST pull-down实验和Co-IP实验其实是相互补充的两种实验方法，通过二者结合，我们才能更准确地了解两个蛋白之间的真实互作情况。

3、可是当IP抗体搞不到该怎么办！不是所有抗体都可以做IP，植物、昆虫、甚至病毒的IP抗体很难找的！
当然也不是没办法， 酵母双杂交还是很适合研究蛋白互作的，在活细胞内进行检测，也能检测到存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。

如果有其它需求呢就再根据你的需求去做实验的搭配验证。比如想要高通量地筛选可以考虑蛋白质芯片（Protein Microarray）。


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