HTRF——时间分辨荧光共振能量转移技术（TR-FRET）金标准

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什么是FRET？
1946 年德国物理化学家Theodor Förster 首次提出荧光共振能量转移理论（FRET）并进行研究。直到 20 世纪 70 年代，FRET技术才被应用于生命科学和诊断领域。
荧光共振能量转移（FRET）是指当一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一个基团（受体）的吸收光谱有一定的重叠，并且这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100Å，10nm），供体能量将向受体转移，简单地说，就是在供体基团激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程，此能量转移过程不涉及光子的发射和重新吸收。
什么是HTRF？
均相时间分辨荧光（HTRF, Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）是一种基于 FRET 的技术，荧光基团结构源于 Jean-Marie Lehn 的诺贝尔奖获奖作品的镧系元素复合物。 由于这些荧光染料的化学和光物理特性，HTRF 在稳定性和特异性方面表现出出色的性能，可以进行数天的重复读板。HTRF 供体荧光基团的独特结构也使得其对大多数实验条件具有高度耐受性，包括螯合物、DMSO、离子强度、挑战性阳离子、pH、温度或细胞培养基。
这些荧光团可以耦合到相互作用的两个蛋白上，这样当蛋白彼此足够接近时，染料也会随之靠近。通过能量源(例如闪光灯或激光)激发供体，触发向受体的能量转移，受体又在给定波长发出特定的荧光(图1)。



图1： FRET信号源于两个荧光基团的靠近

HTRF同时结合了标准的FRET技术与时间分辨荧光，以消除瞬时的背景荧光。如图2所示，在系统激发和荧光检测之间引入约50至200µs的时间延迟，可以清除所有来自体系的非特异性的短时间发射的信号。相反，由于HTRF供体属于长半衰期的镧系元素，HTRF受体接受来自供体荧光基团的FRET，会发出长寿命的荧光。因此，时间延迟后检测到的长寿命发射光，来自生物分子的靠近而产生的能量转移。



图2：时间分辨原理

HTRF 技术的主要特点
· 均相无需洗板，加样孵育即可检测，大大提高筛选通量
· 在生物测定条件下稳定，耐受大多数化学物质
· 无光漂白，允许多次检测读数
· 随着时间的推移信号保持稳定（长达数小时和数天）
· 样本需求量低，适合珍贵样本
应用广泛：GPCR通路；受体配体结合；激酶活性；生物标志物；细胞因子定量；抗体检测；互作分析；胞内蛋白修饰等等

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