技巧篇 | Elisa样本测值低的原因

空白派

ELISA 实验中，实验者经常会遇到样本测值低的问题，样本类型包括血清、 血浆、组织匀浆、细胞裂解液等。假设客户的操作完全正确，标准曲线良好， 这种情况样本测值低可从两方面进行分析：一是样本本身含量可被检测，但由 于实验操作等原因导致样本测值不在试剂盒检测范围内；二是分析物在样品中 本身浓度偏低。下面将从这两个方面来进行分析导致样本测值低的因素以及对 应的解决方案。
1.样本本身含量可以被检测，有哪些原因导致测值低呢？
1）试剂盒的保存
试剂盒要按照规定的方法保存，实验者在购买试剂盒时请务必留心试剂盒 不同组分的保存方法。如优尔生的试剂盒建议检测液 A、检测液 B、标准品以及 酶标条等储存在-20 度，而其它标准品稀释液等储存在 4 度。
2）样本上样前的准备
这个过程包括样本的制备、保存以及是否有经历过反复冻融。样本的制备 要根据样本类型采用不同的方法，血清、血浆与细胞裂解液的制备方法均不同。 保存，包括保存温度以及保存时间。一般推荐样本制备后进行分装后储存在-20 度或-80 度，储存时间不宜过久，因为长时间的储存有可能导致目标蛋白的降解， 致使检测结果不理想。最后注意不要反复冻融，蛋白样本反复冻融会导致降解 发生。
3）稀释方案
样本的稀释对于实验的成功至关重要，稀释过度以及稀释不足均有可能导 致样本的测值低。
稀释过度：一般情况下客户都会根据文献测值，以及检测范围估计一个稀 释倍数，优尔生的试剂盒在出厂之前也会做大量检测，对于常规样本如血清血 浆，我们也会根据实验室样本测值情况推荐一个稀释倍数。但实验者如果直接 按照估计或推测的稀释倍数进行稀释检测后，发现样本 OD 非常低。这是由于文 献作者用的样本，优尔生实验用的样本与实验者的样本会存在一定的差异，这 些测值有一定的参考意义，但如果照搬，可能会导致实验失败。所以建议实验 者在正式试验前是先做预实验确定样本的有效性以及最佳稀释倍数。预实验， 可参考文献，将样本进行梯度稀释，最后选取样本 OD 落在标准曲线中间位置的 点的稀释倍数。
稀释倍数不够：钩状效应，Elisa 实验中发生钩状效应主要是当抗原与抗体 比例不合适而导致假阴性的现象，抗原过量称为后带效应。当样本中目标物含 量很高，而没有进行正确的稀释，就有可能会导致假阴性反应。解决方案依旧 同稀释过度的解决方案一样，在正式实验之前做预实验。


2.分析物在样品中本身浓度偏低
很多时候，客户操作没有问题，标准曲线良好，但检测多次样本依然不在 检测范围。像细胞因子，如 IL-6 需在炎症刺激情况才会大量产生，一般非炎症 样本测值会非常低。针对这种测值比较低的情况，一般建议根据文献选取适合 的样本类型，同时可以选用高灵敏度的试剂盒，优尔生针对某些容易出现测值 低的指标都有研发出高灵敏度的试剂盒，如 IL-6 等。
以上就是实验者在实验过程会遇到的样本测值低的部分原因，以及一些分 析以及解决方法。当然，具体问题还需具体分析。成功的 Elisa 实验依赖于质 量过硬的试剂盒，恰当处理的样本以及良好的操作技能。
更多信息，请访问 http://www.cloud-clone.us/。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/242082022