选对酶，选好酶，分子诊断才能更精准！

非诚勿扰孟非

随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入， PCR 已成为一门相当成熟的常规技术。DNA聚合酶是分子PCR反应中DNA扩增的核心酶，为不同的检测应用选择最合适的聚合酶是PCR成败与否及检测性能高低的关键因素。
DNA 聚合酶有很多种不同类型，每种都具有不同的性质和特征，包括热稳定性、特异性、持续合成能力、保真度、扩增片段长度和延伸速度等。
我们在这儿对分子诊断中最常用的几种聚合酶进行归类比较。

Taq DNA聚合酶
最初用于PCR的DNA聚合酶是20世纪70年代初期发现的来源于大肠杆菌 DNA聚合酶I上的 Klenow片段，但是这种大肠杆菌酶对热敏感。现代PCR反应中更为广泛使用的是从嗜热细菌水生栖热菌分离出来热稳定性Taq DNA聚合酶。
随着蛋白质工程技术的发展，科研人员通过基因突变、结构重组和热启动修饰的方法对Taq DNA聚合酶进行工程改造，使得酶的稳定性、特异性、扩增能力等方面都得到了加强。其中，通过热启动修饰的Taq聚合酶是运用最广泛的。
DNA聚合酶在 20℃~37℃下仍有一定聚合酶活性，容易在试剂配制和预热过程产生非特异性的扩增。
DNA聚合酶在 20℃~37℃下仍有一定聚合酶活性，容易在试剂配制和预热过程产生非特异性的扩增。
➢一种有助于避免非特异性扩增的解决方法是在冰上制备 PCR 反应混合物。较冷的温度有助于降低 DNA 聚合酶的活性；然而，在 PCR 开始之前，仍可能会合成不需要的产物。
➢另一种解决方案是对Taq DNA聚合酶进行热启动修饰，在PCR开始前DNA 聚合酶活性被封闭，在体系配制及升温过程中没有酶的活性，从而有效防止了非特异性扩增和引物二聚体的形成；在较高温度热激活一段时间后，DNA聚合酶活性得以恢复。使用这种热启动技术DNA聚合酶，可以提高PCR反应特异性和灵敏度。



热启动修饰Taq酶活性

Taq DNA聚合酶较为常用的修饰方法为抗体修饰、化学修饰和适配体修饰，几种修饰方法原理各有不同，也有各自优缺点：



热启动修饰技术对比

如果想了解更多关于Taq聚合酶的工程改造和热启动修饰的详情，可以扫码下图二维码收看迈迪安往期直播回放《“酶”力无穷：赋能卓越的分子诊断性能》：

https://wx.vzan.com/live/tvchat-396539635?v=1689737129634 (二维码自动识别)

高保真聚合酶
普通Taq DNA聚合酶不具有外切核酸酶结构域，因此缺乏3´→5´外切核酸酶活性（又叫纠错/校对活性），不具备纠正功能，PCR反应的保真性较低，出现碱基错配的几率为2.1×10-4左右，因此不宜使用在保真性要求较高的实验，如基因筛选、测序、突变检测等等。
而高保真DNA聚合酶则具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性。在PCR扩增过程中，当引物与模板完全互补时，进入聚合域。在聚合酶活性的作用下，游离的脱氧核苷酸通过互补配对的原理依次与引物的3′端结合，新的DNA链从5′端向3′端延伸。
当引物末端结合的核苷酸未与模板配对时，错配的核苷酸会引起结构扰动。新的DNA链不能继续向前延伸，然后进入核酸外切酶结构域。 在外切酶活性的作用下，错配的核苷酸被切除。 切除后，核苷酸会正确重组，新的DNA链可以继续从5'延伸到3'。 最终，可以精确复制新的DNA链。

，时长01:15
高保真聚合酶纠错原理
市面现在最常见的高保真酶是Pfu和KOD两种。Pfu提取自超嗜热古菌激烈火球菌（Pyrococcus furiosus），KOD提取自柯达热球菌（Thermococcus kodakaraensis）。高保真酶由于具有核酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，这两种原始酶现经过基因工程改造，已经可以实现更高效率，更高的保真性和更快的延伸率。
现代市场趋势是使用融合酶，将高保真聚合酶与 双链或单链DNA融合。例如，将来自硫磺硫叶菌的Sso7d双链DNA通过三个氨基酸连接在Pfu DNA聚合酶的C端上，得到的Pfu-sso7d融合酶，就是现在用的最广泛的Phusion高保真酶，它增加对DNA的亲和力并防止聚合酶在DNA延伸过程中从DNA模板“脱落”，从而大大提高持续合成能力性，提供更快速和更高保真度的扩增 。
Pfu酶的保真度大约是Taq聚合酶的10倍，而这种“新一代”高保真Phusion聚合酶的保真性可以达到Taq聚合酶的 50-300 倍以上。



迈迪安高保真Pfu Mix（MDX006）保证性能与同类高保真酶对比

Bst聚合酶
Bst DNA聚合酶是一种来源于硬脂酸杆菌 (Bacillus stearothermophilus) 的DNA聚合酶I，它具有5’- 3’的DNA聚合酶活性和强链置换活性， 但缺乏5’- 3’的外切酶活性。强链置换活性使Bst DNA聚合酶能够在恒温条件下合成DNA，是等温DNA扩增的理想选择，如环介导的等温扩增（LAMP）、等温螺旋酶依赖性扩增（HAD）和等温多重交叉置换扩增（MCA）。
迈迪安的Bst DNA聚合酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶I的大片段，具有较快的5´-3´DNA聚合活性和强大的链置换活性，搭配优化的缓冲液可提供最快的扩增速度（更快 TTR）、更高的扩增产量、高耐盐性和高灵敏度。



迈迪安无甘油Bst酶（MDX018）的快速扩增性能

选择合适的DNA聚合酶
选择正确的酶原料对分子诊断检测的成功至关重要。Meridian迈迪安生物科技在Taq聚合酶研发和生产方面具有30年的丰富经验，我们的科学家团队致力于开发最先进的分子酶，提高检测的精确度和性能，旨在为分子检测提供高性能的诊断原料。
多年来，迈迪安坚持通过成熟和专业的生产和质控技术，严格控制大肠杆菌污染，保证Taq酶的最优活性。



更值得一提的是，决定PCR扩增性能的并不只是酶，整个体系的缓冲液配方（盐，pH, Mg，稳定剂，加强剂，核苷酸等）的每一个组分都会影响反应的性能。只有当各组分优化地搭配在一起，才能发挥出酶的最大活性。迈迪安提供的酶均搭配优化好的先进缓冲液体系，最大程度简化优化过程，让好的酶达到最优的性能！



关于北京迈迪安生物科技有限公司
Meridian Bioscience
北京迈迪安生物科技有限公司是Meridian Bioscience在中国设立的全资子公司。Meridian BioScience（以下简称：迈迪安）是一家全球领先的生物诊断公司，总部设立在美国，距今已有45年的历史。迈迪安公司分为诊断和生命科学两个部分，在中国地区的主营业务是生命科学产品，包括各种分子和免疫诊断检测的关键原料，如抗原抗体、免疫阻断剂、PCR和LAMP反应的聚合酶和优化的预混液、核苷酸等，为人体、动物、农业、环境及食品安全等各种检测提供全面的解决方案。45年来，迈迪安已经成为全球各领域诊断企业的首选原料供应商！

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/652234491